黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性

1、9期 王 岩等：黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性1817黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性王 岩1，冯明鸣1，刘西莉1，司乃国2（1中国农业大学农学与生物技术学院，北京100094；2 沈阳化工研究院 ，沈阳 110021）摘要：【目的】研究黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性，明确建立敏感性基线的生物测定方法。【方法】本研究以专性寄生菌黄瓜霜霉病菌为靶标菌，采用凹玻片法和叶碟保湿法，测定了该病原菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性。【结果】研究结果表明，烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌休止孢的萌发没有影响，对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放、游动孢子游动、芽管伸长、菌丝扩展、孢囊梗形成及孢

2、子囊产生均有抑制作用，而且对黄瓜霜霉病菌的游动孢子释放、游动孢子游动和芽管伸长有显著的抑制作用。其中对黄瓜霜霉病菌的游动孢子释放和芽管伸长EC50值分别为0.0250和0.0037 g·ml-1；并且当烯肟菌酯浓度为0.05 µg·ml-1时能使游动孢子消解，抑制休止孢的形成；当药剂浓度为5 g·ml-1时，对病斑的扩展和孢子囊产生抑制率分别达到60.41%和92.10%，且对孢囊梗的产生也有显著的抑制作用。【结论】综合考虑试验方法的可操作性和稳定、准确性，推荐使用叶碟保湿法测定烯肟菌酯对菌丝扩展的EC50，用以建立敏感基线并进行田间抗药性监测。关键词：

3、烯肟菌酯；黄瓜霜霉病菌；发育阶段；敏感性Sensitivity of Pseudoperonospora cubensis at Different Development Stages to EnostrobilurinWANG Yan1, FENG Ming-ming1, LIU Xi-li1，SI Nai-guo2(1College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094; 2 Shenyang Research Institute of Chemical Industry,

4、 Shenyang 110021) Abstract: 【Objective】 The bioassay method of baseline sensitivity was developed on the basis of the effect of enostrobilurin on Pseudoperonospora cubensis at different development stages during its life cycle. 【Method】 The sensitivity was determined by concave-slide and the leaf di

5、scs assay in vitro respectively. 【Result】The results showed that enostrobilurin did not show any effect on cystospore germination, but prevented the zoospore release, zoospore motility, germ tube elongation, hyphal growth, sporangiophore emergence from stomata and zoosporangial formation. The EC50 v

6、alues of enostrobilurin to zoospore release and germ tube elongation were 0.0250 g·ml-1, 0.0037 g·ml-1 respectively. Enostrobilurin resulted in zoospore breakdown at 0.05 g·ml-1 and inhibited obviously hyphal growth, sporangiophore emergence from stomata and sporangial formation at 5

7、g·ml-1.【Conclusion】 These studies suggested that leaf discs assay in vitro was an accurate and reliable method to determine the EC50 values of flumorph to P.cubensis, the baseline sensitivity and the resistance strain in field. Key words: Enostrobilurin; Pseudoperonospora cubensis; Different de

8、velopment stages; Sensitivity0 引言【本研究的重要意义】通过研究烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌不同发育阶段的影响，明确建立敏感性基线的生物测定方法，并为进一步系统研究黄瓜霜霉病菌对烯肟菌酯抗药性机制提供参考，为明确药剂的最佳使用时期及指导田间科学施药提供理论依据。【前人研究进展】甲氧丙烯酸酯类杀菌剂是20世纪90年代初开发的一类新型杀菌剂，其杀菌谱广，能同时有效地防治多种病原真菌和卵菌引起的病害，对环境和非靶标生物安全、友好，并且具有全新的作用机制，与目前使用的DMIs、苯酰胺类、二甲酰亚胺类和苯并咪唑类杀菌剂无交互抗性，从而引起了全世界的关注，并得到广泛应用16。这是继

9、苯并咪唑类和三唑类杀菌剂后，再次震撼杀菌剂领域的一类具有广泛影响的新颖杀菌剂。本试验研究药剂烯肟菌酯（enostrobilurin），商品名为佳斯奇，是由沈阳化工研究院1997年开发的国内第一个甲氧丙烯酸酯类杀菌剂。该药剂杀菌谱广、活性高，具有预防及治疗作用。目前已申请了中国（CN1191670）、美国、日本及欧洲专利，2002年完成农药临时登记，登记靶标对象为黄瓜霜霉病菌 79。【本试验的切入点】目前未见有关该药剂对病原菌不同抑制阶段和作用机制的研究报道。【拟解决的关键问题】本试验以目前生产上使用的嘧菌酯（商品名Amistar）为对照药剂10,11，研究黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯和对

10、照药剂的敏感性，用以建立敏感基线，并进行田间抗药性监测的生物测定方法。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试黄瓜品种 精选长春密刺，市售。1.1.2 供试菌株 黄瓜霜霉病菌，由中国农业大学种子病理药理研究室自田间未施用过甲氧基病烯酸酯类杀菌剂的黄瓜栽培地采集分离。1.1.3 供试药剂 98%烯肟菌酯（enostrobilurin）和95.6%嘧菌酯（azoxystrobin），分别由沈阳化工研究院和先正达农化有限公司提供。1.1.4 试剂和仪器 0.001% Calcofluor White M2R（pH 8.0）染色剂（简称CWMR），购于Sigma公司； Olympus BX60多

11、功能显微镜（WU激发，波长365 nm）。1.2 试验方法1.2.1 黄瓜霜霉病菌的采集、分离和保存 从北京郊区未施用过甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的黄瓜栽培地采集黄瓜霜霉病叶，用无菌水清洗病叶上的杂质和老的孢子囊，然后保湿于培养皿中，置于19、RH>80%、光暗交替条件下培养，待叶片上产生大量新的孢子囊后， 用无菌水洗脱单病斑上产生的新孢子囊，转接到已采集的健康离体叶片上，于19、RH>80%、12 h光暗交替的生长间培养，备用。1.2.2 孢子囊悬浮液的配制 用4无菌水洗脱经1.2.1处理后在离体叶片上扩繁产生的孢子囊，配制成浓度为每毫升含1×105个孢子囊的悬浮液。1.2

12、.3 系列浓度药剂的配制 98%烯肟菌酯、95.6%嘧菌酯分别以丙酮、甲醇为溶剂，配制成1×104µg·ml-1溶液作为母液，放置于4冰箱中备用。试验时将母液用无菌水分别配制成系列浓度药液（稀释液中甲醇的含量控制在体积分数为0.1%以下），以含有相同浓度甲醇的蒸馏水为空白对照，进行叶片处理时药液中加入体积分数为0.005%的Tween-20，以增加药液在叶片上的展着和渗透。1.2.4 杀菌剂对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放的影响 将配制好的黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液和系列浓度药剂各20 µl同时滴加到凹玻片上，在19黑暗的生长间保湿培养，3 h后待对照中80%

13、以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察并计算100个孢子囊的空囊率，每个浓度重复4次12。1.2.5 杀菌剂对黄瓜霜霉病菌游动孢子游动、游动孢子萌发及芽管伸长的影响 将配制好的黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液20 µl滴加于凹玻片上，置于19、RH>80%黑暗生长间中培养。（1）3 h后待对照中多于80%的孢子囊释放，分别加入系列浓度的药剂20 µl。继续培养1 h后，显微镜下观察（×100），并记录100个孢子的游动孢子个数。（2）4 h后待大于80%的游动孢子形成休止孢，再滴加系列浓度的药剂继续培养3 h，用显微镜观察休止孢萌发的情况并记录100个休止孢的

14、萌发率13。（3）施药5 h后，待对照的休止孢萌发率达到50%以上，CWMR染色，通过显微镜观察照相，并用Image-Proplus Version 5.0软件测量芽管长度。1.2.6 杀菌剂对黄瓜霜霉病菌菌丝扩展、孢囊梗和孢子囊形成的影响 采用叶碟保湿培养法，将10 µl孢子囊悬浮液接种在黄瓜叶盘背面（直径为1.5 cm），于19黑暗的生长间保湿培养48 h，测量并记录病斑面积，然后将叶盘在系列浓度的药剂中浸泡10 min，继续培养96 h，每个浓度重复50个叶盘，待对照叶盘产生黑色霉层，病斑扩展比较明显的时进行如下处理：（1）再次测量病斑面积，计算不同药剂系列浓度处理后病斑扩展率

15、；（2）在叶盘上直接滴加CWMR染色14，并在荧光显微镜下（×200）观察孢囊梗的形成情况，记录每视野内孢囊梗的数目；（3）计算单位病斑面积上的产孢量。2 结果与分析2.1 杀菌剂对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放和游动孢子游动的影响研究结果如表1、图1所示，烯肟菌酯和对照药剂嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放和游动孢子的游动均表现出明显的抑制作用，其中对游动孢子释放的EC50值分别为0.0250 g·ml-1（y = 3.0041x + 9.8144，R2 = 0.9231）和0.0097 g·ml-1（y = 5.5431x + 16.155，R2 = 0.963）；

16、且当嘧菌酯浓度为0.05 µg·ml-1时能完全抑制游动孢子的游动，嘧菌酯浓度为0.1 µg·ml-1、烯肟菌酯浓度为0.05 µg·ml-1时能使游动孢子消解，抑制了休止孢的形成。2.2 杀菌剂对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发和芽管伸长的影响研究结果如表2、图2所示，烯肟菌酯和对照药剂嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发没有抑制作用，但当药剂浓度为5 µg·ml-1时，两种药剂都能使休止孢表1 药剂对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放和游动孢子游动的影响Table 1 Effect of fungicides on zoospore r

17、eleased from zoosporangia and zoospore motility of P. cubensis药剂浓度Concentration（g·ml-1）游动孢子释放率（%）/抑制率（%）Percentage of released zoosporangia（%）/ Rate of inhibition（%）游动孢子游动率（%）/抑制率（%）Percentage of zoospore（%）/ Rate of inhibition（%）烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobi

18、n0.00094.25A92.00A83.33A83.33A0.00589.75B/4.7488.25B/4.0867.00B/19.6050.00B/40.000.00786.75C/7.9678.00C/15.2261.00C/26.8022.00C/73.600.01082.50D/12.4724.75D/73.1058.00D/30.4010.00D/88.000.05013.5F/85.680.00F/100.00+0.00E/100.000.1001.75G/98.140.00F/100.00+0.500-+数据后不同的大写字母代表处理间的显著差异(P=0.01)，以下各表相同。+

19、：游动孢子消解；-：未试验Number followed by same letters are data significantly different at P=0.01 level according to Duncans multiple range test. The same as in the following tables. +: Zoospore breakdown; -: No dataDABCEFS ZCESZA、B、C、D、E、F代表0.000，0.007，0.010，0.030，0.050 g·ml-1浓度药剂对黄瓜霜霉病菌的游动孢子释放和游动孢子游动的影

20、响；S游动孢子未释放的孢子囊，ES游动孢子释放后的空孢子囊，Z游动孢子, ZC游动孢子消解A, B, C, D, E, F showed the effect of a concentration series of enostrobilurin on zoospore released from sporangia and zoospore motility at 0.000, 0.005, 0.007, 0.010, 0.030, 0.050 g·ml-1, respectively; SZoosporangia undischarging zoospore, ESEmpty z

21、oosporangia, ZZoospore, ZCZoospore breakdown图1 烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌的游动孢子释放和游动孢子游动影响Fig.1 Effect of fungicide on zoospore released from zoosporangia and zoospore motility of P. cubensis消解。烯肟菌酯和嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌芽管伸长均有显著的抑制作用，EC50 值分别为0.0239 g·ml-1（y = 2.8147x + 9.5618，R2 = 0.9298）、0.0145（y = 0.5699x + 6.047，R2 =

22、 0.8051）。2.3 杀菌剂对黄瓜霜霉病菌菌丝扩展、孢囊梗形成和孢子囊产生的影响试验结果（表3、图3）表明，随着处理药剂浓度的提高，烯肟菌酯和嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌病斑扩展的抑制作用加强，当药剂浓度为5 g·ml-1时，两种药剂对病斑扩展的抑制率分别为60.41%和83.05%，表明这两种药剂对病原菌菌丝在细胞间隙的扩展均有一定的抑制作用。试验中也观察到（图2）药剂对黄瓜霜霉病菌孢囊梗的形成具有一定的影响作用，当药剂浓度高于0.5 g·ml-1时，随着药剂浓度的增加，黄瓜霜霉病菌孢囊梗的产生数量逐渐减少。当烯肟菌酯和嘧菌酯浓度为5g·ml-1时，显著地影响了孢囊

23、梗的形成，且两种药剂对黄瓜霜霉病菌孢子囊产生的抑制作用也分别达到92.10%和100%。表2 药剂对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发和芽管伸长的影响Table 2 Effect of fungicides on cystospore germination and length of germ tube of P. cubensis药剂浓度Concentration（g·ml-1）休止孢萌发率(%)/抑制率(%)Percentage of germinated cystospore(%) /Rate of inhibition (%)芽管长度(m)/抑制率(%)Length of germ t

24、ube(m) /Rate of inhibitionp(%)烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin0.00060.33A60.33A79.29A79.29A0.00569.33A/-14.9161.00A/-1.1141.93B/47.1255.29B/30.260.01060.33A/0.0071.00A/-17.6825.41C/67.9538.43C/51.530.05056.75A/5.9456.50A/6.3517.44C78.0022.08D/72.150.50059.00A/2.2159

25、.25A/1.7916.03C79.7818.82D/76.265.000+10.000+：休止孢消解 Cystospore breakdownDABCEFA、B、C、D、E、F分别代表0.000，0.007，0.010，0.030，0.050 g·ml-1浓度药剂对黄瓜霜霉病菌的休止孢萌发和芽管伸长的影响A, B, C, D, E, F showed the inhibition of a concentration series of enostrobilurin on cystospore germination and elongation of germ tube at 0

26、.000, 0.005, 0.007, 0.010, 0.030, 0.050 g·ml-1, respectivelyABBED图2 烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌的休止孢萌发和芽管伸长的影响Fig. 2 The effect of cystospore germination and enostrobilurin on elongation of germ tube of P. cubensis表3 药剂对黄瓜霜霉病菌病斑扩展和孢子囊形成的影响Table3 Effect of fungicides on the extension of lesion and sporulation of

27、 P. cubensis 药剂浓度Concentration(g·ml-1)病斑面积(mm2)/抑制率(%)Lesion area (mm2)/ Rate of inhibition(%)单位面积孢子囊形成数目(mm2)/抑制率(%)Number of zoosporangia per mm2 (mm2) / Rate of inhibition(%)烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin烯肟菌酯Enostrobilurin嘧菌酯Azoxystrobin0.00095.92A196.25A1470.27B1747.83A0.005100.59A/-4.87

28、178.75A /8.922017.39C/-37.211538.23C /11.990.01089.25A/6.95193.40A /1.451803.33A/ -22.651631.58B / 6.650.05083.71A/12.72184.00A /6.241350.33D/8.141368.16D / 13.550.50039.82B/58.48160.00B /18.47365.00E/75.171396.86 E / 20.085.00037.97B/60.4133.26C /83.05116.13F/92.100.00f / 100.0010.00013.00C /93.380

29、.00f / 100.00：未试验 No dataDABCEFA、B、C、D、E、F分别代表0.000、0.005、0.05、0.1、0.5、1 g·ml-1浓度药剂对黄瓜霜霉病菌的孢囊梗形成的影响A, B, C, D, E, F showed the effect of a concentration series of enostrobilurin on the emergence of sporangiophore at 0.000, 0.005, 0.05, 0.1, 0.5, 1 g·ml-1, respectively图3 烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌孢囊梗形成的影响

30、Fig.3 The effect of enostrobilurin on the emergence of sporangiophore of P. cubensis3 讨论3.1 嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌发育阶段的影响与朱书生等14报道的一致。烯肟菌酯和嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌不同发育阶段的作用效果相似，对黄瓜霜霉病菌的休止孢萌发阶段没有抑制作用，对黄瓜霜霉病菌的孢子囊释放、游动孢子游动和芽管伸长有显著的抑制作用，由此推测烯肟菌酯和嘧菌酯可能具有相同的作用机制及存在着交互抗药性，建议烯肟菌酯不可与目前市场上广泛推广使用的嘧菌酯交替和重复使用。目前有关烯肟菌酯作用机制和抗药性机制目前还未见具体报道。

31、已有研究表明，嘧菌酯主要作用于真菌的线粒体，药剂与线粒体电子传递链中复合物（Cytbc1复合物）结合，阻断电子从Cytbc1复合物流向Cytc，破坏能量合成从而抑制真菌生长或杀死真菌1519。本研究结果为进一步探讨烯肟菌酯作用机制和抗药性机制提供了参考。3.2 已有研究报道表明，嘧菌酯对大多数植物病原真菌和卵菌有很强的抑菌活性，既能抑制菌丝生长又能抑制孢子萌发，但对于病菌不同发育阶段作用效果不同，对大多病菌的孢子萌发抑制作用优于菌丝生 长6, 20。本试验研究结果表明，黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对药剂表现出不同程度的敏感性，其中在供试浓度下对休止孢的萌发没有影响，对菌丝扩展有明显的抑制作用。因此

32、，在相关的生物测定试验中，不宜采用常规的孢子萌发抑制法测定烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌的抑菌作用。基于药剂对菌丝生长的抑制作用，并综合考虑试验方法的可操作性和稳定、准确性，推荐使用叶碟保湿法测定烯肟菌酯对菌丝扩展的EC50，用以建立敏感基线并进行田间抗药性监测。4 结论4.1 黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性研究结果表明，烯肟菌酯和嘧菌酯对黄瓜霜霉病菌的休止孢萌发阶段没有抑制作用，对黄瓜霜霉病菌的游动孢子释放、游动孢子游动、芽管伸长、菌丝扩展、孢子囊梗形成、孢子囊产生各阶段均有抑制作用，而且两个供试药剂对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放、游动孢子游动和芽管伸长有显著的抑制作用。4.2 研究表明，叶

33、碟保湿法稳定性和准确度高，可操作性强。推荐使用该方法测定烯肟菌酯对菌丝扩展的EC50，并用以建立敏感基线及进行田间抗药性监测。4.3 烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌不同发育阶段的影响不同，表明烯肟菌酯兼有保护和治疗的双重作用，因此生产中可作为保护和治疗剂使用。并且应避免烯肟菌酯与目前市场上广泛推广使用的嘧菌酯或同类其它杀菌剂交替和重复使用。References1 张舒亚, 周明国. 甲氧丙烯酸酯类杀菌剂的生物学及应用技术研究. 见：中国植物病害化学防治研究（第三卷），北京：中国农业科学技术出版社，2002：1-10.Zhang S Y, Zhou M G. Research on biology an

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