融合蛋白标签

1、在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯 化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。 因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋 白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、 酵母菌表 达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白别离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质， 特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质

2、分子特异性结合的 能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的别离纯化中。在重组蛋白的亲 和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达， 通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组 蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、 适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异

3、性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、 适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高 度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用 途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化 配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tag U等；另一类是识别小分子 配基的蛋白标签，如GST MBP等。短肽标签： His-tag : His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多 种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为515个组氨酸

4、，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：1位于目标蛋白N端的 His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；2His标签几乎不影响目标蛋白的理化性质；3His标签很小，不会改变目标蛋白的可溶性； 4His标签在目标蛋白结晶后对蛋白结构几乎没有影响；5采用固定化金 属离子亲和层析纯化His标签融合蛋白时，其操作非常简便。基于上述优点，几 乎所有的大型结构基因组研究中心都把纯化His标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析immobilized metal-ion affinity chromatography， IMAC 作为主要的蛋白纯化方法。然而，并不是所有的蛋白质都可以与 H

5、is标签融合后，采用固定化金属离子 亲和层析别离纯化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然发生的组氨酸丰富区域，在固定化金属离子亲和层析时可能会导致其他蛋白的非特异性结合； 目标蛋白含有 金属离子，一般也不米用His标签与固定化金属离子亲和层析。FLAG-tag：除了 His标签外，另一个广泛使用的小分子短肽标签是FLAG标签。FLAGB签是由8个氨基酸DYKDDDD组成的一个短肽，分子量很小，因而不会 遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的外表，便于利用抗 体检测；同时含有一个肠激酶切割位点DDDK，可以利用肠激酶

6、切除标签。FLAG 标签有3个特异性的单克隆抗体，分别为 M1单抗、M2单抗、M5单抗。FLAG短 肽合成本钱较高，不适用于大规模纯化，且需要额外步骤除去结合在层析介质上 的短肽。Strep-tag n：与 His-tag、FLAG-tag 相似，Strep-tag U 也是一个小分子的短 肽标签，广泛用于多种目标蛋白在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统等的表 达与纯化中。在自然界中，链霉亲和素streptavidin丨与生物素biot in丨之 间存在着非常强烈的非共价相互作用，其生物学上的解离常数极低；即使生物素与其他蛋白质共价结合之后，两者仍可以相互作用。基于这两者之间的强烈相互 作用，

7、运用一系列蛋白质工程手段，通过对短肽文库的筛选，第一个链霉亲和素 结合肽应运而生，即 Strep-tag，极大地方便了重组蛋白的一步快速亲和纯化。 然而，Strep-tag与链霉亲和素结合时需要一个自由的羧基末端，因而该标签只 能位于目标蛋白的C端，限制了它的应用范围。在Strep-tag的根底上，通过对 合成短肽的筛选，获得了一个与其相似、由8个氨基酸 WSHPQFEK&成的链霉 亲和素结合肽，即 Strep-tag n，可以位于融合蛋白的任意位置，从而弥补了Strep-tag的缺乏。同时，通过对链霉亲和素特定氨基酸的定向突变，获得了与 Strep-tag U具有更高亲和力的亲和介质

8、 Strep-tact in ，在Strep-tag U融合蛋 白的亲和纯化中表现出良好的纯化效果，且蛋白质产量较高，所需本钱适中。Strep-tag U系统的纯化条件比拟宽泛，在普通缓冲液下就可与strep-Tactin n 融合蛋白洗脱下来，螯合剂、去污剂、复原剂 及高达1mol/L的盐均可参加到缓 冲液中。此外，Strep-tag n在纯化过程中不依赖金属离子， 十分适合含金属离 子蛋白质的纯化。蛋白标签：GST GST标签由211个氨基酸组成，大小约为26kDa,是目前广泛用于重组蛋白 融合表达与亲和纯化的一种蛋白标签。大量的表达实验发现，外源蛋白在大肠杆菌表达系统中过量表达时，常会以

9、包涵体的形式形成不溶性的聚合体，大大降低 了可溶性重组蛋白的产量，增加了后续蛋白别离纯化的难度。然而，在融合GST标签进行原核表达的过程中发现，原本用于亲和纯化的GST标签能在一定程度上增大融合蛋白的可溶性，使融合蛋白以可溶形式存在于细胞质中，不仅促进了目标蛋白的正确折叠，提高了蛋白产量，而且有助于后续的蛋白纯化。除了增大 融合蛋白的可溶性之外，GST标签还具有高效的翻译起始、纯化条件温和、亲和 树脂本钱相对低廉等显著优点，成为重组蛋白融合表达经常使用的亲和标签。MBP MBP标签由大肠杆菌K12的malE基因编码的396个氨基酸组成，大小约为 40kDa,是除了 GST标签之外又一个很好的增

10、大融合蛋白可溶性的蛋白标签。MBP标签能够增大在原核表达系统中过量表达的融合蛋白的可溶性，提高其表达量，已在多个表达实验中得到确认。研究发现，当改变MBP “开放与“关闭构象之间的平衡时，MBP增大融合蛋白可溶性的能力将受到明显影响，说明MBP增大 融合蛋白可溶性的特性是由其“开放构象所介导；同时，对MBP配基结合间隙中保守的疏水性氨基酸残基进行定向突变，MBPS现出相似的表型，说明这个配基结合间隙在MBP增大融合蛋白可溶性的机制中具有一定的作用。然而，从蛋白纯化的角度来看，MBPg签并不是一个最有效的亲和标签；在某些 情况下，MBP标签并不能特异性地与亲和树脂有效结合，亲和层析后融合蛋白的

11、纯度也并不适宜。自从上世纪70年代中期亲和标签融合技术出现以来，多种多样的短肽或蛋白亲和标签极大地方便了外源表达重组蛋白的别离与蛋白质复合体的纯化，已成为蛋白质研究领域不可或缺的工具。 一般而言，一个完美的亲和标签应该具备以 下特性：1能够用于纯 化任何表达宿主或表达系统所表达的重组蛋白；2可以位于目标蛋白的任意位置而不影响其结构；3增大目标蛋白的可溶性， 促进其正确折叠，提高蛋白表达量；4便于重组蛋白的检测。目前，商品化 的亲和标签已具备其中诸多特性，但性能更加优越、纯化效果更加显著的亲和 标签仍需不断寻找与开发。重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。 特别是体内功能 研究和蛋

12、白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。美国GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出 3类，分别为 表达宿主为大肠杆菌， 哺乳动物细胞的， 以及慢病毒载体， 宿主可以为哺乳动物 细胞和原代细胞。除了必要的复制和筛选的元件， 协助表达和翻译的元件外， 本文将各类载体 分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：His6：His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特 的结构特征结合配体利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力， 可用于固定化金属螯合层析IMA

13、C，对重组蛋白进行别离纯化。使用 His-tag 有下面优点：1. 标签的分子量小，只有0.84KD,而GST和蛋白A分别为26KD和30KD 一般不影响目标蛋白的功能；外表活性剂存在的条件下或变性条件下纯化， 前者在纯化疏水性强的蛋白得 到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用， 用高浓度的变性剂溶解后通过金属 螯和亲和层析去除杂蛋白， 使复性不受其它蛋白的干扰， 或进行金属螯和亲和层 析复性；3. His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；4. His 标签免疫原性相对较低， 可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备 抗体；5. 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和

14、；6. 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。Flag:Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽DYKDDDD，同时载体中构 建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1. FLAG 作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究2. 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变 性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。3. FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便

15、通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。4融合在N端的FLAG其可以被肠激酶切除DDD从而得到特异的目的 蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其 蛋白相互作用等相关领域。MBP:MBP麦芽糖结合蛋白标签蛋白大小为 40kDa,由大肠杆菌K12的malE基 因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。 MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。 如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白

16、可用 10m M麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋 白在 0.2% Triton X-100 或 0.25% Tween 20 存在下不能有效结合，而其他融合 蛋白那么不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M,但不能使用变 性剂。如果要去除MBF融合局部，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用MBPK体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。GST:GST谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作 用的转移酶，它的天然大小为 26KD将它应用在原核表达的原因大致有两个， 一个是因为它是一个高度可溶的蛋白， 希 望可以利用它增加外源蛋白的可溶

17、性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达， 起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可 以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用 10mM复原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的， 并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护 重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或局部可溶的纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有复原 型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose) 亲和树脂进行纯化。GST标签蛋 白可在温

18、和、非变性条件下洗脱，因此保存了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力， 因此不能在纯化缓冲液中参加强 变性剂如：盐酸胍或尿素等。如果要去除GST融合局部，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。HAHA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA源于流感病毒的红细胞凝集素外表抗原 决定簇， 9 个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小 , 容易构建成标签蛋白融 合到N端或者C端。易于用Anti HA抗体检测和ELISA检测。c-MycC-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列 Glu-Gl n-Lys- Leu-I

19、le-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu ，这11 个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白 质框架中仍可识别其相应抗体。 C-Myc tag 已成功应用在 Western-blot 杂交技 术、免疫沉淀和流式细胞计量术中 , 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白 / 增强型黄绿色荧光蛋白 / 增强型黄绿色荧光蛋 白/单体红色荧光蛋白 ,具有不同的激发波长发射波长为， 均由野生型荧光蛋白通 过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP而言，相对于GFP其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的 Kozak序列使得含有eGF

20、P的融合蛋白在真 核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体 红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验说明， mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能 相互没有明显影响。 这些荧光标签蛋白， 其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1. 不用破碎组织细胞和不加任何底物， 直接通过荧光显微镜就能在活细胞中 发出绿色荧光， 实时显示目的基因的表达情况， 而且荧光性质稳定， 被誉为活细 胞探针。2. 其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在 细胞中的定位等情况。3. 同时细胞内的其

21、它产物不会干扰标签蛋白检测， 从而使其检测更显得快速、 简便、灵敏度高而且重现性。4. 其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现 eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、 转基因功能研究、 蛋白在细胞中的功能 定位、迁移变化及药物筛选等方面。5. mCherry 红色荧光蛋白在标记病毒颗粒， 研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用 mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒，研究H1V和宿主细胞 问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程用 mRFP标记慢病毒颗粒，研究慢 病毒在小鼠体内的复制过程等。荧光素酶 来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧

22、光素酶和Guassia 荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白被用于分子生物学研究中， 这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法 Luciferase Assay 。跟普 通融合蛋白标签不同， 使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。 因此常用于研究启动子、miRNA3'UTR克隆的功能与调控，因为它们对目的基因 的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。优点：灵敏度高，检测幅度宽；不是哺乳动物细胞内源性基因；重复性好；与HTS兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化 研究。由于它们都是快速， 容易和高灵敏的监测方法。 而且萤火虫和海肾荧光素

23、 酶是理想的双基因报告系统， 因为它们来源于不同的生物进化方向， 蛋白结 构和底物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。基于荧光素酶的特性，我司研发提供的 Secrete-Pair? Dual LuminescenceAssay Kit可用于分析双报告系统中 Gaussia荧光素酶GLuc和分泌型碱性磷 酸酶(SEAP)活性。GLuc和SEAP匀为分泌型报告蛋白，无需裂解细胞即可便捷的 从细胞培养液中取得样本，并对实验结果进行精准的实时分析。Avi TagAviTag 标签蛋白是一个 15 个氨基酸的短肽， 具有一个单生物素化赖氨酸位点，与天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C

24、端。融合表达后， 可被生物素连接酶生物素化， 为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物， 除了用于蛋白质别离纯化， 还用于蛋白质 相互作用研究。Avi Tag 标签系统具有以下几大优点 :1. 无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的 Avi Tag位点 轻易且有效地被生物素化；2. 生物素化是通过酶和底物的反响来实现， 反响条件相当温和而且标记的专 一性极高；AviTag 只有 1 5个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。SNAP-TagSNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优 点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，

25、如活细胞内、溶液中、或固态相 (如 SDS-PAGE gels)等。SNAP-Tag是从人的 06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移06-alkylguanine-DNA- alkyltransferase获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团如荧光素和假设丹明。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团， 释放出了鸟嘌呤。 这种新的硫醚键共价结合使 SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标 记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用， 所以SNAPB签反响是高特异的。检测：生物素或各种颜色荧光的底物如荧光素、假设丹明可渗透进入细 胞，方便快捷地进行活细胞内 SNAP-Tag融合蛋