估及抗药性菌株的分子检测技术研究

1、硕士学位论文估及抗药性菌株的分子检测技术研究 中文摘要 Cea Rostr 为靶标 本研究以专性寄生菌黄瓜霜霉瘸菌 挑d够e"DnD!ppr口cubensisq卧rket 菌，探讨其不同发商阶段对烯肟菌精的敏感性，确定了烯肟菌酪辩黄瓜耩霉病菌的毒力涮定方法， 并建立了黄瓜霜霉精菌对烯肟蓝酯的敏感基线；进行了该病原菌对烯肟越酯的室内抗性飙险评估及 田问抗药性检测；研究了黄瓜霜霉瘸菌对烯肟菌酯产生抗药性的分子机制，由藏建立了抗药性随株 的分子检测方法。获褥以卜m研究结皋： 1黄瓜霜霉病菌不同发育阶段对烯肟菌酯的敏感性结果说明，烯肟菌酯对黄瓜霜霉病菌的休Ir 稳蘸发没鸯季荦翻箨稿，霹荧淹震

2、霉瘸莲瓣游动手蓬予释兹、游秀孢子游动、芽营 枣长、装旌扩展、氇 子囊梗形成、孢子囊产生均有抑制作用，而且对黄瓜霜霉病菌的孢子囊释放、游动孢子游动和芽管 律长有显著f 孽捧翻传臻。蒸手药翻辩蘸篓垒茨舂静隶?终嗣，对体| 德静翡发没存影璃，并综会考虑 试验方法的可操作性和稳定、准确性，推襻使用叶碟保湿法测定烯肟菌酪对菌丝扩展的EC50以建 立霜撵病菌澍烯耪藤酯静敏感基线。 2扶北京、天溥、内蒙古、湖l等来使爿I过烯黔藏酝鞠嗣类恭萤刹的黄瓜栽培她采撰52株黄 瓜耩霉病菌，采用叶碟保湿法测定艇对烯肟菌酯的敏感性。绪果说明，EC分布于 性频率分布星连续单峰曲线，接近正态分布，尚未出现敏感性下降的抗药性群

3、体，蹶此可以采刚供 试蓬株豹平均ECso作为黄瓜霾霉薅藩对爝辑藿醍瓣敏感鏊线，势蠲予翻阏抗药蠛箍测。 3室内抗药性风险评储说明，采用紫外诱变和药剂驯化的方法诱导均可获得抗烯腑省酯的突变 体，EC岛分布子10-5omml，抗瓣性指数为80-502倍。其中紫井诱交方法较翡翔戮德方法更赫 获得抗药性突变体，且其抗性水平高于药剂驯化方法。局部生物学性状研究显示，突变体的抗药性 状稳定，其致病力、适合魔恭 竞争力与亲本敏感菌株相比没有明擞差异或优予紊本菌株。烯肟藩酯 与脯谴菌酯之间存在正交互抗药性，与氟吗啉、耩脲氰和甲霜灵之间均光交互抗药性。综合分析表 明，黄瓜霜霉病菌对烯肟酾酯具有较高的抗药性风险，在

4、| l间自然情况卜抗药性菌株可能形成优势 菌群，建议生产上斑格烯黔越酯与其它无!蹙互抗性的药剂交替使用或混合使圳，以防止或延缓抗势 性的产生。 4+密阕拨药性整羲l试骏表锈，隧着撬棼次数鹃增魏，筵豫霸霉病蘸对烯嚣藏酪兹域缮性貉嚣下 降，试验中监测发现两株低抗药性德株，抗性倍数分别为476、384。 5病原菌抗药性分子桃制研究结果说明，与敏感菌株线粒体曲藻因局部氨基酸序列眈对， Fnu4Hl的酶切位点。进一步通过生物信息举技术分析了药荆靶标位点01蜘基因结构，结果说明L77 靼All3均币在燎瓣蕴蘸麓结合区域悫，霹蛙这舞个氢基酸静突变也没毒骥Cytb基因绫会霹域嬲结 构发生明显的变化，因此推测黄

5、瓜耩霉病菌线粒体中Cytb基因的143位氨基酸的突变是靶标菌对烯 舞藏穗产生羧蛙的主要原丞。 6建立了抗药性菌株的分子检测方法。采用ASPCR和CAPS方法进行抗药饿菌株的检测，可 获得与传统擞物测定方法相同的检测结果。与传统方法相比，分子检测方法可缁缀检测时间、提高 检测效率，因此可作为田间抗性菌槠早期诊断的理想方法。 关键词：爝粒薅穗，黄瓜霜霉病藤，竣感基线，抗药性风险，挽药性分子机制，分子检测 l Abstract Theeffectofenostrobilurinonthedifferent inthelife of stages cyclePseudoperonospora deve

6、lopment cubensiswasstudied，TheresultsshowedthatenostrobilurinhadUOeffecton eystosporegermination，but the release tube zoospore elongation，hypha preventedzoospore motility,germ fromstomataand ofenostrebilurinto release emergency sporangialformationThe丑 value zoospore and tube was made germ elongation

7、 zoospore breakdownat andinhibited fromstomata 005#gml obviouslyhyphagrowth，sporangiophOreemergency and formation at spomngial obviously5,ugm1 The andHubaiin2003 determinednvLtrothek曩fdiscs baseline Innermongolia and2005，were by assay髓e to sensitivities as from to witha ECs0 00030ugmL enostrobihirin

8、，expressedvalues，ranged 0031399mk ThesensitivitiesofallisolatesdistributedasaunimodelCurveandno mealof 00101±00031 ugmL resistant baseline wassuitableforfieldresistance subpopulationappearedThus,thissensitivity monitoring The riskof曼cubensistoenostrobilurinwasassessedinthis laboratoD"resis

9、tance paper骚n enostrobilurin-resistantmutantswereobtained andUV-irradiation throughfungi西deadaptation method， with and levelof values from t0 highfrequencyhigh resistance，whichECso ranged12驰gmL361mmL andresistancefactorswere80-502Furthermorethemutantsinduced UVwere levelof easilyby higher resistance

10、than thoseselected characteristicsofmutantsindicatedthatthe byadaptionSomebiological and ofthe were enostrobiinrin-rasistantmutantsnot pathogenicity,fitnesscompetition significantly differentfromthatoftheir髓rentalstminsTheresistantlevelofenostrobilurin-resistantmutantswasstable afterlOdiseaseon leav

11、eswithoutenostrobilurinDataalsoshowedthattherewasa cycleshealthy positive CROSSresistancebetweenenostrobilufinand notwith azoxystrobin，but studiesrevealedthatenostrobilurinwasa risk laboratory high fungicideTherefore，the epidemic oftheresistant ofPcubensiswouldbe infieldItWaS thatthe development pop

12、ulation possible suggested enostrobilurin shouldbealternatedormixturedUsewithother whichhavenotcross-resistantto fungicides avoidor the ofresistance， delaydevelopment Twolow resistancestrainsweremonitoredinthefieldtreated withenostrobilurintwelvetimesa year A mutationWas sindepoint L77Mfoundinlowres

13、istancestrainsfromthefieldandtwo sindepoint mutations All3G，G143Awerefouudinallmutantsfromthe evaluationThe G143A laboratory sequence lnlheresistancestrainscouldbe Fnu4HI recognized bioinfotmaticsshowedthe by Although analysis domain wasassociatedwith of酾of置cubensis strobilurin，u7andAll3werenot inth

14、e present domain?Thedidnot theconstructionof change change amutationat the咖pocketThisstudysuggested 143wasa reasonforlhe of position major strobflurinresistanceinthe rapiddevelopment mutants high H Inthe theAS-PCRandCAPSwere todetectG143Amutationandtheresultsofthetwo study developed were to methodss

15、imilartraditional methodcostedless methodsHowever,molecular biological biology timethantTaditional methods biological risk to sensitivity,resistancefungicide， resistance detectionnthod mechanism,molecular biology P938411 独创性声明 本人声瞻所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表

16、或撰 鬻过豹研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书面使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何奉献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：圣老 时间：名胗多年月Fj 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保存送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或局部内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名：每当 时问：夕缈年彳月IH 挪签名：卟咱 时间：彳年月矿

17、一 第一章前言 11病原菌抗药性的研究现状 自19世纪中叶巴斯德建立了病原学理论，提高人类对病害防治的自觉性：1882年法国波尔 多大学Millardet发现波尔多液能防治葡萄霜霉病的作用，开创了人类有意识合成无机和保护性杀 菌剂防治植物病害历史。儿个世纪以米，化学防治在植物病害的综合治理中一直占据着重要地位， 发挥了巨大的作削。20世纪60年代中期以前，用于植物病害防治的药剂主要为一些非选择性， 多作用靶点的保护性杀菌剂，如取代苯基类的百菌清、双二硫代氨基甲酸酯类的代森锰锌及些 铜制剂等“谱型保护性杀菌剂，病原菌不易对其产生抗药性，因此抗药性的问题并未引起人类的 关注。自上个世纪70年代以来

18、，随着植物痫害化学防治丁作的开展，内吸性杀菌剂因其显著的 生物活性和优异的内吸传导性曾得到广泛和频繁地应用，使植物病害的防治取得了划时代的进 展。但由丁-该类杀菌剂作用位点单一，病原菌易产生抗药性，而且抗性水平会随着药剂的选择压 力的提高而不断提高，最终可能直接导致化学防治的失败。由于在新药剂的使用初期，人类对抗 药性风险评估未给予足够的重视，忽略了抗药性检测和治理措施，致使病原菌的抗药性问题不断 显现利日趋严重。其中最具代表性的杀菌剂为苯酰胺类药剂甲霜灵，1977年商品化，1980年在 23年后，即形成了抗药病原群体，并随着使用年代 霜霉病，马铃薯晚疫病等卵菌病害，但使_ ； j 的延续和施

19、药次数频繁，药剂防病效果逐渐降低甚至防治失败，目前在大局部地区的抗药性菌株 频率超过50，局部地区抗药性水平高达万倍以上 李炜，1998：毕朝位，2002 。现己报道有 多种植物病原菌分别对甾醇生物合成抑制剂、二甲酰弧胺类杀菌剂、氨基嘧啶类杀菌剂、苯并咪 唑类杀菌剂、黑色素合成抑制剂和甲氧丙烯酸酯类杀菌剂产生了较高水平的抗药性。 伴随着病原菌抗药性问题的发牛，开展和目趋严霞，人们逐渐认识到了对杀菌剂进行抗药性 风险评估、抗药陛监测和治理的必要性。1981年国际农药J：业协会成立了杀菌剂抗性行动委员会 ResistanceAction FRAC，Fungicide Committee ，开辟了植

20、物病理学和植物化学保护学新的研究 领域。目前FRAC已经成立了甾醇生物合成抑制剂、二甲酰亚胺类、苯并咪唑类、苯胺嘧啶类、 苯基酰胺类和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性工作组03rentKJ，1998 。杀菌剂抗药性研究在国际上 也受到，。泛重视。目前在欧美新药剂申请产品登记时，必须提供有关产品的抗药性风险分析报告 及相应的抗药性治理策略，修订的EPPO 欧洲和地中海植物保护组织 指导方针中也进一步详 述了杀菌剂抗药性文本要求。国外一。些人的农药公司在开发新农药的同时，投入大量的科研经费 _I j丁研究新药剂的抗药性风险和抗药性机制，建立抗药性检测技术及合理的抗药性治理策略，在 一种新产品推向市场的同

21、时，基r抗药性风险评估和抗药性机制的研究，检测技术和抗药性防治 策略也同时推出。而我国在这一研究领域还处_非常落后的状况，国内从事农药抗药性研究的单 位很少，在抗药性方面的研究大多是针对已产生的抗药性进行监测和治理，而对于一种新药在大 面积推广之前进行抗性评价和抗性机制研究儿乎没有。国家有关新农药刨制研发中也鲜有对丁抗 药性风险研究的专项经费支持，尤其在杀菌剂抗药性研究方面更为突出。这种情况极大地影响了 我国创制产品的国际认知度和市场潜力，同时由于国内杀菌剂的实际应用较抗药性研究更为超 前，导致投入巨资创制的新型药剂可能面临抗药性产生，使用寿命缩短等巨大的风险。 12病原菌抗药性风险评估 “植

22、物病原物抗药性是指对杀菌剂敏感的野生型植物病原物个体或群体，由于遗传变异出现 普遍的接受，即田问的抗药性突变是一个自发的过程，但突变的原因不是因杀菌剂的诱变，突变 一般发生在杀菌剂使用之前，杀菌剂仅起到了一个选择的作用，杀死了敏感个体，使抗性个体得 以表现出来。因此在田间是否会发生抗药性和抗性水平问题，主要取决于“杀菌剂病原物组 合本身的内在因子，包括杀菌剂的作用机制和作用特点，病原菌群体中潜在的抗药性基因，抗药 性遗传学特征和适合度等。 植物病原物对杀菌剂的抗药性风险由根本风险和治理风险组成。根本抗药性风险由病害和药 剂决定，满足F列条件之一意味着具有抗药性风险： 1 药剂作用位点单一： 2

23、 与现用药剂之 间有交互抗性关系； 3 药剂杀菌活性高、持效期长形成很高的选择压力； 4 抗药性由单基因 突变控制； 5 病菌繁殖周期短、产孢量大、扩散速度缓慢；突变处理、药剂选择、有性杂交获 得适合度蚶的抗药菌株； 6 发病条件适宜 王英华，2003 。 一般杀菌剂使用之前或之初可根据人工诱变、药剂选择或驯化试验、田问敏感卤株敏感性变 异、抗药性菌株的生物学及遗传学特征、杀菌剂作用方式等进行根本抗药性风险预测；实验室抗 药性研究是新农药应用前评估抗药性产生风险的重要手段。通常情况下病原物群体中存在着 10410。10的单基因抗药性突变频率，如果通过在室内诱变和基因转导等处理可以大大提高突变频

24、 率，获得抗药性菌株。依据抗药性类型、抗药性开展速度、药剂之间的交互抗性关系、抗药基因 类型、基因数和对致病力的影响，抗、敏基因的相对适合度等内容研究评估农药抗性风险。杀菌 剂使用数年之后，可根据人工诱变、药剂选择或驯化、田问药效与抗药性发生、抗药性菌株的生 物及遗传特征、杀菌剂作_ lj方式与使用对策等资料，并结合已有的根本抗药性风险预测数据进行 抗药风险评估 Brent，1999 。目前人们通常采用初步探测、早期评估、回忆分析、分类评估等 13病原菌产生抗药性的机制研究 131病原菌抗药性的生化机制 目前已有多类杀菌剂抗药性机理研究说明，降低亲和性是病原物产生抗药性最重要的生化机 制。病原

25、物只要发生单基闭或少数寡基冈突变就可以导致病原物靶标位点结构的改变，而降低对 专化性曲剂的亲和性。虽然病原物一般不会同时发生多基因的变异而降低与多作用靶点化合物的 亲和性，但是生理生化代谢可以发生某种变化，修饰细胞壁或生物膜的结构，阻止药剂到达作用 靶点，或者减少对药剂的吸收，或者增加排泄，减少药剂在细胞内的积累等表现抗药性。真菌对 苯酰胺类、羧酰替苯胺类杀菌剂产生抗药性就是分别在相应的作片J靶点mRNA聚合酶和琥珀酸 辅酶Q复原酶复合体发生构象改变，降低了药剂与这些靶点的亲和性而表现抗药性。创制杀菌剂 抗药性的研究可以从这些研究方法和结果中得以借鉴。 l-32病原菌抗药性的分子机制 随着分子

26、生物学技术的开展及在病原菌抗药性机制研究方面的应用，多种病原菌的抗药性分 子机制已经明确。目前报道病原菌对杀菌剂产生抗性的机制主要是药剂作用的靶标位点发生点突 变，即靶标位点的空间结构发生变化，药剂与靶标位点的结合能力下降。不同的病原菌抗性菌株 靶标位点突变位点不同，而且同一种病原菌不同抗药性水平菌株突变位点也可能不同。下面介绍 病原菌对几类杀菌剂产生抗性的分子机制。1 病原苗对苯并咪唑类杀菌剂fMBC 抗性机制。苹 Jones，AL 果黑星病菌 Venturiainaequalisl koenraadt,Hand Luck JE，GillingsMR，1995 和油菜菌核病菌 Sclerot

27、inia 7002 等多种病原菌对苯并咪唑类杀菌剂 MBC 抗性机制是病原苗的B微管蛋白基因发生革碱 基突变，使药剂与病原菌的B微管蛋白的亲和力下降，药剂无法与作用位点结合，即不能发挥杀 由Phe TrC 突变为1 TAC LuckJE，1995 。1998年Gareth 对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性是B微管蛋白的50位氨基酸发生突变由1W突变为Cys Gareth H报道 致病菌Penicillium 的靶标位点P“。的过量表达。抗性菌株中编码P。50的PdCYPSl基因的启动子区域的转录增强子 有多个重复单元，导致了P450的过量表达，杀菌剂的作用效果降低，致使病原菌对该药剂产生抗 性 H

28、iroshi P450氧化酶的CYP51发生点突变 Liannis 脱氢抑制剂 MBID 抗性机制。2004年Haruko Sawada报道稻瘟菌 Magnaporthegrisea 对 变，75位氨基酸由Val突变为Met Haruko Sawada，2004 。4 许多病原菌对甲氧丙烯酸酯类 杀菌剂 001 抗性机制。病原菌对甲氧丙烯酸酯类杀菌剂 ooI 产生抗药性主要是由丁病原菌的线 目前已报道细胞色素b基因中共有11个抗药性突变位点 张舒亚，2002 。 133病原菌对strobilurins抗性发生和开展情况及抗药性机制 蟊 甲氧丙烯酸酯类杀菌剂由丁作朋位点单一，且作用靶标白发突变频

29、率高，在药剂的高选择压 力r病原菌容易产生抗药性群体。室内抗药性研究说明，这类杀菌剂具有中等抗药性风险。但是， 该类杀菌剂1996年在欧洲开始用于小麦白粉病的防治，1998年在德国北部三个地区检测到抗性 个体，抗性倍数 500。1999年，在德国的其它地区及法国、比利时、英国和丹麦也检测到了抗性 菌株。1999年Ishii等报道在日本监测到黄瓜硐I甜瓜上的门粉病荫和霜霉病菌的抗药性群体。田 I可抗性开展情况与室内预测不相符合。国际杀菌剂抗性行动委员会 FIu屺 于1997年成立了 QDl杀菌剂活性与抗性工作组 STAR ，经过科学的研究分析说明，该类杀菌剂具有高抗药性风 险，并制定了该类杀菌剂

30、的治理方针和推荐使用守那么 张舒亚，2002 。 表11对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗药性的病原菌 Pathogen 触Host G删eogra怖phica。挪eofI押 resi型sta。篆：“。 c1甜1 如tribu“on Alternariaalterna衄 Alternaria US G143A 1，2 tenussima,Pistachio Alternariaarborescens Alternariamall Apple US G143A 3 Alternariasolani Potato US F129L 4 Blumeria ginis8ptriticf Whtd EU G

31、143A Barlcv 5 andhordei Colletotrichum US G143A 6 graminlcolaTurfgrass cassiicola Cucumber Japan G143A Corynespora Didymellabryoniae Cucuthit US G143A f81 Glomerella strawberries G143A f9 cingulata Japan CentralandSouth Banana G143A Mycosphaerellafijiensis America，ameoon， 10 Philippines Mycosphaerel

32、lagraminicolaWheat EU GJ43A 1112 nattrassii G143A 13 Mycobellosiella Eggplant Japan viticola EU G143AandF129L 14 Plasmopara Grape cubensis Cucurbits EU，Asia G143A 05，16 Pseudoperonospora Pyrenopho。 Barlcvandwheat EU F129L 17 P tritici?repentis US G143Aand PyriculariagriseaTuffgrass F129L 1819 Pythiu

33、maphanidermammTurfgrass US F129L 20 Cuanrbits EU，Asia G143A 21，22 Spearotheca且liginea 坠坐坐!：型!i： 生也! ；! Q!坠 l：!? 国外有关甲氧丙烯酸酯类杀菌剂抗药性分子机制的研究说明，多数病原菌对strobilurins产生 抗药性是由丁线粒体出基因氨基酸143位发生点突变，由甘氨酸变成了丙氨酸 G143A 。氨 基酸的改变导致。出基因结构也发生了变化，使药荆不能与其结合，降低了药剂与靶标之间的 的求年¨力。病原凶的线粒体cy曲基网氨基酸143何发生点突变后，病原曲的致病力和适合度并 没有发

34、生明显的变化，在田间很容易成为优势群体 NicholasF，2004 。但是有些病原真菌氨基 酸的突变位点不是在143位，例如瓜果腐霉菌和稻瘟菌，抗药性的产生是由于线粒体出基因 氨摹酸129位发生突变，即F129L由苯丙氨酸变为亮氨酸。单个位点发生突变的机率比拟大，两 个或多个位点同时发生突变的机率较小。经人鼍研究证明抗性突变体发生突变的区域主要集中在 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 氨基酸127147位发生突变，表现高水平的抗药性。Ishii等人的试验研究说明黄瓜霜霉病菌和 向粉病菌对腈嘧菌酯 商品名：阿米西达 产生抗药性的主要原因就是Cytb基因的G143A发生 报道现已在世界不

35、同地区的检测到18种病原菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗药性的菌株， 井己明确其抗性机制 表11 。 14病原菌抗药性检测方法 常规病原菌抗药性检测方法有以一FJb种，菌落生长测定法、菌丝干重测定法、孢子萌芽测定 法、孢子产生营测定法、琼脂展布法、抑菌圈测定法、叶盘漂浮测定法。菌落生长和菌丝干重测 定法能准确反映杀菌剂对菌体生长的抑制作用；孢子萌芽测定法适于测定容易产生孢子的真菌和 对孢子萌发有抑制作用的杀菌剂；孢子产生量测定法和叶盘漂浮测定法对专性寄生菌适用，如小 麦锈病和黄瓜霜霉病菌 慕立义，1991 。这些方法都需要通过测定药剂对病原菌的Ec50来比拟 敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个

36、处理，屡次重复。检测周期长、T作量大、消耗的人力资 源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变频率在l以上才能被检测 到。由于病原菌的繁殖、传播速度一般都很快，在自然界存在的数量又很大，冈此经过几次药剂 选择后，抗约性病原皤群体可能会成为致病病原群体中的主体，造成病害大流行。 病原茵的生理生化性质的改变，会导致抗药性的产生，所以目前也可廊用生理生化方法检测 抗药性菌株，分析不同抗药性水平病原菌中某一特定的酶或蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，比拟 抗药性菌株与敏感菌株的差异，检测抗药性菌株。目前已有报道，比拟分析核盘菌不同水平抗药 性菌株之间可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱，检测核盘菌对

37、速克灵抗药性菌株 李新风，2003 。 随着分子生物学技术飞速开展及应用范围不断扩展，分子技术开始在病原菌抗药性检测中的 应用，与传统的检测方法比拟，不但节省了检测时间、提高了J一作效率，而乩提高了检测的灵敏 皮，检测频率在1010。，更适_ j于检测低频率抗药基因，因此也被作为田间抗性早期诊断的理 想方法。本章主要介绍病原菌抗药性分子检测及监测方法。 141病原菌抗药性SNP检测系统 病原菌产生抗药性的主要原因是杀菌剂作用位点发生点突变，用检测单核苷酸多态性方法检 测病原菌抗药性菌株，简称SNP检测系统。SNP检测系统中最直接的方法就是利用生物信息学 从已有的基冈信息库中搜寻基因序列，通过基

38、因序列的比对寻找单核苷酸的多态性。但是这种方 法要求基冈序列，所以廊用的局限性较大。此外，最常用的SNP检测方法还有许多种，这些 方法根据其原理可分为以FJL种类型，1 基于PCR以及酶切的方法，如突变特异性扩增 ARMS 、 PCR-RFLP、RAPD及real-time quantitativePCR等；2 基于杂交的方法，主要包括等位基因特异 寡核苻酸片段分析 Alelle-special Oligonucleotide，ASO 、基因芯片技术 GeneClips ；ffl毛细血管电 泳 Capillary 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 GradientGel GradientG

39、el Electrophoresis, Electrophresis,TGGEl、变性梯度凝胶电泳 Denaturing StrandConformation DC,GE 、单链构象多态性 Single Performanc2 技术 DcnatudngHigh Liquid 用比拟高 欧阳建华，2003 。在杀菌剂抗药性研究领域中，目前报道用于检测单碱基突变的抗 药性菌株的方法主要有以下几种： mutation 1411突变特异性扩增 amplWwafionrefractory system,ARMS 突变特异性扩增 ARMS ，直译放大受阻突变体系，又称为等位特异性PCR Allele SpecificPCRASPCR 。其根本原理是，在一对引物之一的3端设计一个碱基与突变碱基配对， 这样此引物由予3端与正常DNA不配对而在PCR反响中不能延伸，突变的DNA那么可以延伸。因而 可将一段正常DNA与该段突变DNA 分开。此方法具有快速、简便、非放射性等特点，得到广泛应 用。在此根底上，针对不同点突变可设计多个错配引物，在一个反响体系中进行PCR反响，即多 allelespecific 重等位基因特