核磁共振技术的研究进展

1、核磁共振技术的研究进马晓菲摘要：核磁共振技术是一种测定化合物结构的强有力手段，具有不破坏样品、检测速度快、信息丰富、方法灵活等特点。由于受到人们对其灵敏度、精确度的质疑，核磁共振技术的应用范围远不及色谱和质谱技术。但随着磁场强度的提高，高敏探头的出现及实验方法的改进，核磁共振技术的灵敏度已大幅提高，其在药学领域的应用前景将会越来越广阔。本文从核磁共振技术的仪器进展，方法进展，应用进展三方面进行综述。关键词：核磁共振 高敏探头 固体高分辨 联用技术 应用前言 在磁场中用无线电波照射分子时，能引起原子核自旋能级的跃迁。原子核能级跃迁时核磁矩方向的改变而产生的感应电流，即核

2、磁共振的信号。 核磁共振（NMR）最早由Bloch、Purcell发现并获得诺贝尔物理学奖，经历了固体高分辨核磁共振、脉冲傅里叶变换技术、核磁共振成像、高场谱仪的出现等一系列重大突破，从早期的单一的核物理的应用领域拓展到化学，食品，医学，药学，生物学，遗传学以及材料科学等领域，并成为研究工作的有力工具。 与其他分析手段相比，核磁共振具有如下优势：1.鉴定和检测的同步性2.不破坏样品，试剂可回收3.样品制备方法简单4.测定迅速、操作简单、重现性好5.检测方法灵活多变。但由于核磁共振灵敏度较低，相比于色谱和质谱，其应用范围相对小得多，并一度成为其发展的瓶颈。近年来，随着磁场强度的提高，高敏探头的出

3、现，实验方法的改进，以及人们对核磁共振关注的提高，国内外对其研究报道明显增加。本文从核磁共振技术的仪器进展，方法进展，应用进展三方面进行综述。1. 仪器进展1.1磁体技术 核磁共振谱仪的硬件主要构成可以分为四个部分，磁体、探头、数据采集和接收系统、操作系统。磁体的功能是产生一个恒定的磁场，仪器的灵敏度与磁体提供的磁场密切相关。现代核磁共振超导磁体需要液氮液氦提供的低温条件来维持磁体的超导状态，维护成本非常高。针对这一问题，布鲁克公司研制出 Ascend Aeon系列磁体。它能将磁体内挥发出的氦气直接液化重新加注回磁体，完成氦气的循环，避免了重复添加液氮的麻烦，极大地简化了磁体的维护工

4、作，降低了维护成本。并且Ascend Aeon系列磁体表现出极佳的磁场均匀度和最小的漏磁场，极大地促进了NMR的发展。1.2探头 1.2.1超低温探头 探头则置于静磁场之中，用于激发检测核并探测核磁共振信号。超低温探头把低温技术与先进的射频硬件设计结合起来，用低温的氦气来冷却探头检测线圈到25K，前放电子线圈到70K附近，最大程度降低了检测到的电子噪声，探头检测灵敏度提高4倍以上。 1.2.2微量探头 微量探头是超小型探头, 通过减少溶剂的体积而相应增加样品浓度，适用于样品量小的情况，特别是适用于天然产物研究领域，本身的线圈设计使得其能达到与低温探头相当的高灵敏，并且微量探头安装与维

5、护简便。 1.2.3流动探头 流动探头能够在样品流动的情况下检测溶液中的结构信息。这种探头能够完成样品的实时检测，并能与HPLC和质谱联合在一起，组成LCNMRMS的强大分析工具。 1.3 样品变温装置 变温核磁共振实验在物质结构分析和化学反应跟踪等应用中有着重要的作用。布鲁克公司研制的Thermometer技术通过检测两种氘共振的化学位移差值来实现完全自动化温度控制，与传统的热电偶检测法相比，NMR Thermometer直接测量样品实际温度，不再依赖于热电偶，从而避免在去偶实验或控温气流变化时外部热电偶测温导致温度偏差。2.方法进展2.1固体高分辨核磁共振 普通核磁共振波谱仪所测样品多为液

6、体, 物质在固态时的许多性质在液态时是无法观察到的。固体分子中分子之间位置相对固定，各向异性作用效果显著，NMR谱线比液体宽得多，进而导致分辨率的降低。固体高分辨核磁共振主要通过魔角旋转法、偶极去偶法、多脉冲去偶法、交叉极化法等来获得高分辨谱图。 现在固体NMR已广泛用于研究无机材料（如分子筛、催化剂、陶瓷、玻璃等）和有机材料（如高分子聚合物、膜蛋白等）的微结构。固体高分辨核磁共振在高分子材料方面的研究较多，利用固体NMR 谱图和各种弛豫参数，人们可以表征材料的分子结构进而监视反应的进度。固体NMR不仅为聚合物分子结构的解析提供了丰富和可靠的信息，同时NMR的各个参数也可作为机械性能及动力学研

7、究的重要手段。2.2多维核磁共振 傅里叶脉冲变换技术促进了多维核磁共振技术的发展。引入二维后，不仅可将化学位移、偶合常数等参数展开在二维平面上，减少了谱线的拥挤和重叠；而且通过提供HH、CH、CC之间的偶合作用以及空间的相互作用，确定它们之间的连接关系和空间构型，有利于复杂化合物的解析，特别是天然产物和生物大分子的结构鉴定。 但随研究对象分子量的增加，质子数目增加，使其谱线重叠亦越加严重, 如何提高分辨又成为关键问题。于是三维核磁共振技术便兴起。美中不足的是, 三维核磁共振实验需时长, 且蛋白质标记过程复杂,一定程度上限制了三维核磁共振技术的广泛应用。 针对多维核磁共振耗时长的问题，近来文献中

8、报道了一种称为Hadamard 谱的快速多维谱方法。在相同的分辨率和信噪比的前提下，基于Hadamard 的快速实验时间比常规实验时间减少约20 倍。2.3联用技术 2.3.1 高效液相-核磁共振（HPLC-NMR） 高效液相-核磁共振仪（HPLC-NMR）联用技术是由液相色谱提供分离技术，核磁共振仪提供结构解析技术，从复杂的药物代谢产物获得单一组分的图谱进行结构推测。解决了固相萃取对于结构复杂的药物代谢产物的鉴定困难的问题。随着核磁共振仪磁场强度的增强，灵敏度有了很大的提高，溶剂峰抑制技术的不断完善，促进了HPLC-NMR 联用技术在药物代谢研究中的发展。 2.3.2高效液相-核磁共振-质谱

9、（HPLC-NMR-MS） 若用核磁共振谱法确定新化合物的结构，则常常需要其他方法的进一步证实。当基团中不含有质子或者质子极易与溶剂进行化学交换，使信号不能被检测，加之一些非磁性的核在图谱中也不会显示，此时NMR 谱就很难提供代谢物的结构信息了。HPLC-NMR-MS联用技术的出现则很好的弥补了这些不足，因为质谱可以提供化合物的分子量，碎片峰也包含了大量的结构信息，为解析复杂的药物代谢产物的结构提供了全面的信息。 2.3.3超临界流体分离-核磁共振(SFC-NMR)(SFE-NMR) 超临界流体是指处于临界温度、临界压力状态下的物质,这时其物理性质介于气体和液体之间。采用超临界流体作流动相的色

10、谱法称为超临界流体色谱（SFC)，采用超临界流体作洗脱剂的萃取法称为超临界流体萃取(SFE)。SFC-NMR和SFE-NM R联用技术避免了HPLC-NMR联用技术中溶剂峰干扰问题,解决了样品在处理过程可能造成的损失、污染或分解,从而提供了一种快捷有效的分离,并能提供混合物的组成和结构信息的分析方法。目前其已成为分析难挥发、不耐热的大分子化合物和生物样品的有效方法。2.3.4 毛细管电泳-核磁共振（CE-NMR） 要将毛细管电泳和核磁共振实现联用，需克服两者进样量差别所带来的问题。CE-NM R方法与常规分离鉴定方法相比大大节省了时间,省去了单调乏味的工作,提供了一种利用快捷有效的分离获取丰富

11、的结构信息的方法。3. 应用进展 3.1代谢组学研究 NMR是当前代谢组学研究中的主要分析技术，特别是1H-NMR，对含氢代谢产物均有响应，能完成代谢产物中大多数化合物的检测，满足了代谢组学对尽可能多化合物检测的目标，它所产生的波谱可检测血浆、尿液、胆汁等生物基质中具有特殊意义的微量物质的异常成分。 代谢组学涉及到的是药物在体内的原型或其代谢物，内源性干扰物质多且浓度低。基于NMR 技术的代谢组学研究主要包含以下几个步骤: 首先针对要解决的问题, 设计实验方案, 采集足够数量的样本；然后进行核磁共振波谱数据采集和对系列NMR 谱进行统计分析， 从而提取不同组别之间代谢物种类和含量的相对变化信息

12、。QNMR技术可以测定药物在体内的变化过程，测定各种代谢物的含量。Abdul 等体外模拟了人微粒体中高度代谢的某种药物，并对其代谢产物进行了鉴别和测定，有利于化学合成及药理学的研究。 3.2 复杂体系药物的定性定量分析 3.2.1 同分异构体混合物的分析 3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲酸是制备化学药物罗氟司特的一个中间体，其同分异构体4-环丙基甲氧基-3-二氟甲氧基苯甲酸常作为伴生产物出现在制备过程中。实现这两种化合物的快速鉴别，对于该类药的工艺研发和实际生产过程的质量监控具有重要意义。邓志威，等在1H NMR 和13C NMR 测试的基础上，采用两种选择性NMR 实验技术完成了对药物合

13、成中间体中同分异构体的鉴别和相对含量的测定。3.2.2顺反异构体混合物的分析 申药报批样品(SY)含有一个非共轭烯烃结构，不仅需要给出分子结构，还需对化合物烯烃基团的顺反式结构和组分含量进行确证。邓志威，等用对苯二酚作为内标参比物，在500 MHz 的谱仪上获取1H NMR 谱。经过解谱，确定了样品顺反异构体的结构和含量。3.3 生物大分子体系的研究3.3.1蛋白质三维结构解析 目前蛋白质的结构测定方法主要是X射线晶体衍射和NMR 技术。 NMR 技术在液态环境下测定蛋白质的结构，可以对蛋白质所处环境的pH 值、盐浓度、温度等进行灵活调控, 因而比X 射线晶体衍射更接近于生理环境。顺磁弛豫增强

14、(PRE)技术是近年来蛋白质NMR 方法学研究的又一重大突破。PRE-NMR 可用于测定1.52.4 nm 的远程结构信息, 以及蛋白质瞬态结构和瞬态相互作用信息。3.3.2蛋白质复合物的动力学研究 蛋白质往往是与其他蛋白质或生物分子形成蛋白复合物而执行功能的。蛋白复合物执行功能的过程中，经历一个相互接触、结构变化、然后相互分离的过程。NMR特别适合研究瞬时存在、不稳定的复合物， 对于溶液中蛋白复合物的研究具有独特的优势，能很好的描述蛋白质肽链的动力学特征。4 结语 核磁共振以其不破坏样品、试验方法多、信息丰富、选择性强和定量分析方法灵活等技术特点，已在化合物的结构鉴定、含量检测、化学反应过程

15、的动态跟踪、生物分子溶液构象研究等方面表现出独特优势，在药物分析鉴定中具有很高的实用价值。近年来，随着磁场强度的提高，高敏探头的出现及实验方法的改进，以及人们对核磁共振关注的提高，核磁共振的应用前景将会越来越广阔。参考文献1. 高明珠，核磁共振技术及其应用进展J，信息记录材料，2011 年第12卷第3 期2. 胡扬，薛佳，陈奇，等，核磁共振及其联用技术在药物代谢研究中的应用J，China Academic Journal Electronical Publishing House3. 张芬芬，蒋孟虹，沈文斌，丁娅，等，定量核磁共振( QNMR) 技术及其在药学领域的应用进展J，南京师范大学学报

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