活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用

1、活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用核心提示：【摘要】【目的】研究活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用。【方法】选用SD大鼠， 【摘要】 【目的】研究活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用。【方法】选用SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组（剂量为10.8mgkg-1d-1）、活血健脑胶囊组（剂量为1.8gkg-1d-1），后3组再分为缺血2h及再灌注6、12、24h组；采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，免疫组织化学法检测神经细胞细胞色素C（Cyt C），原位杂交法检测Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的

2、表达。【结果】活血健脑胶囊组脑缺血/再灌注6 h 细胞色素C阳性弱表达,与模型组比较有显著性差异(P0.01)，脑缺血/再灌注12h、24h 细胞色素C的阳性表达与模型组及假手术组比较无显著性差异(P0.05)。模型组脑缺血再灌注24h海马Caspase3 mRNA、Caspase9mRNA的表达达高峰(P0.01)；活血健脑胶囊组脑缺血/再灌注24hCaspase3 mRNA、Caspase9mRNA表达均减弱, 与模型组比较有显著性差异(P0.01)。【结论】活血健脑胶囊对局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用可能与其能影响神经细胞Cyt C的释放，降低脑缺血/再灌注后脑组织Caspase

3、3、Caspase9的活性，从而阻断细胞凋亡的发生有关。 【关键词】 活血健脑胶囊/药理学； 脑缺血/中药疗法； 脑组织/病理学； 细胞凋亡； 疾病模型，动物； 大鼠 1 材料与方法 1.1 动物与药物 SD大鼠78只，体质量300350g，鼠龄56月龄，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供（合格证号： 0001475）。活血健脑胶囊由上海复星临西制药有限公司提供（批号：200400306）；尼达尔片（尼莫地平），20mg/片，由天津市中央药业有限公司生产（批号：020602）；9g/L的氯化钠注射液由北京双鹤药业有限公司提供(批号:030312312)。 1.2 试剂与仪器 PM10AD光学显

4、微镜 （Olympus optical Co.Ltd，JAPAN）； HITACHI 7500型透射电子显微镜（JAPAN）；LEICARM2145型自动切片机（德国）；phorbol estersil ( at final concentration of 0.20 mol/L) + ionomycin (at final concentration of 1 mg/L) for another 48 hours. After marked by monoclonal antibody of CD3 and CD71, the expression of CD3+CD71+ lymphocy

5、tes was observed by flow cytometry. Results SINO inhibited the lymphocytes proliferation in a concentrationdependant manner, and particularly had an inhibition on Jurkats cells at G0/G1 phase; MTX had an inhibition on S phase. The stimulation of ConA and phorbol estersil+ionomycin obviously increase

6、d the expression of CD3+CD71+ lymphocytes (P0.01); SINO at the concentrations of 1 and 0.5 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after ConA stimulation, and SINO at the concentration of 1 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after stimulation of phorbol estersi

7、l+ ionomycin (P0.05). Conclusion SINO can inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes, and block the cells at G0/G1 phase. Its mechanism may be related with the downregulation of transferring receptor of T lymphocytes and with the decrease of intake of iron ion by the cells. Key words：

8、SINOMENINE/pharmacology; ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD therapy; TLYMPHOCYTES; CELL CULTUREHPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司）；Cyt C 、Caspase3mRNA、Caspase9mRNApon812Lysine液中浸5min，捞片后置5860烤箱中 45min以使切片紧密粘附，干燥备用；切片常规脱蜡至水；蒸馏水新鲜配置体积分数为3%H2O2室温处理10min，蒸馏水洗涤2min3次；切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波修复10min，反复2次，自

9、然冷却后以0.1mol/LPBS洗涤2次；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；甩去多余液体，不洗；滴加50L抗Cyt C，4冰箱过夜，0.1mol/LPBS洗涤2min3次；加入浓度为10g/L的胎牛血清-缓冲液（BSAPBS3 mRNA、Caspase9 mRNA的表达 以40g/L多聚甲醛固定脑组织，石蜡包埋，常规切片（6m厚），脱蜡，水化，以体积分数为30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温510min以灭活内源性酶；蒸馏水洗3次。暴露mRNA核酸片段:切片上滴加柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（30g/L柠檬酸lmL加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，室温消化15min；42预杂交2h，杂交

10、液中含探针2g /mL，42 杂交过夜，加入抗地高辛抗体(1800)，37孵育1h，DAB显色37、30min左右，典型切片加上不含探针的杂交液做阴性对照。参考Kitazawa等5报道的方法计算Caspase3表达程度：计数5个高倍视野，将平均阳性细胞数分为5类，(1)0：阳性细胞少于1，(2)1：阳性细胞介于125；(3)2：阳性细胞介于2550；(4)3：阳性细胞介于5075；(5)4：阳性细胞大于75。根据染色程度将阳性信号分为3类：(1)染色强度弱：+；(2)中等染色强度：+；(3)染色强度强：+。染色强度阳性细胞百分数为每个标本染色的综合记分。综合记分1为表达阴性，否则，则判为阳性。

11、Caspase9的测定同Caspase3稍作改动。 1.6 统计学方法 应用SPSS 11.0 For Windows软件包进行统计分析。 2 结果 2.1 病理形态 假手术组脑组织结构正常，无明显水肿；模型组HE染色缺血损伤累及广泛皮层及纹状体外侧，缺血中心区与周围区界限不易区分，神经元坏死、变性，胞浆嗜酸，胞核溶解，细胞周边呈扇形空泡改变，梗塞中心区可见细胞坏死，部分细胞消失，可见微血管、神经元和胶质细胞。尼莫地平组及活血健脑胶囊组脑组织病理改变较轻，可见神经元、星形胶质细胞呈轻度的肿胀，个别神经元呈变性改变（图1）。 电镜下见假手术组神经元细胞体积大，细胞质丰富，可见粗面内质网、微丝、细

12、胞核大，呈圆形或椭圆形，有13个；常染色质丰富，异染色质较少，可见线粒体轻微肿胀现象。模型组神经元及神经胶质细胞胞体固缩或肿胀；细胞核内染色质凝集成块或溶解，异染色质边集，核膜连续性破坏或凹陷，核固缩或溶解坏死；许多线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊、断裂、消失，线粒体内基质电子密度降低，整个细胞浆呈空化状态。尼莫地平组可见核轻度不规则，核膜完整，异染色质边集现象少见；异形线粒体较少，多数线粒体嵴清楚、连续。活血健脑胶囊组神经元线粒体、内质网轻度肿胀,线粒体嵴几乎正常，有34个初级溶酶体，1个次级溶酶体，细胞核基本正常，可见大而明显的核仁，细胞质丰富，细胞器量较大，粗面内质网及游离的核糖体量较多，可见

13、较多的神经胶质细胞（图2）。 2.2 Cyt C蛋白表达 假手术组仅见Cyt C蛋白弱阳性表达；模型组大鼠脑缺血再灌注2h后Cyt C蛋白开始表达，再灌注6h表达量达高峰，再灌注12h表达量下降，再灌注24h降至最低点。再灌注24h内Cyt C的表达区域主要集中在海马锥体细胞和齿状回区颗粒细胞。活血健脑胶囊治疗组脑缺血/再灌注6hCyt C阳性表达较弱,与模型组比较有显著性差异(P0.01) ,尼莫地平组脑缺血/再灌注12、24hCyt C阳性表达与模型组及假手术组比较均无显著性差异(P0.05)。尼莫地平组脑缺血/再灌注6、12、24hCyt C阳性表达与模型组比较均无显著性差异(P0.05

14、)。结果见表1、图3。 2.3 Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的表达 假手术组基底节、皮层、海马Caspase3mRNA、Caspase9mRNA阳性表达的神经元数较少。 模型组缺血再灌注后不同时间对缺血侧脑组织中Caspase3mRNA、Caspase9mRNA3mRNA、Caspase9mRNA的表达无明显增强,再灌注6h缺血侧海马Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的表达较假手术组及缺血对侧增强, 再灌注12hCaspase3mRNA、Caspase9mRNA的表达进一步增强，于再灌注24达高峰,与假手术组比较有显著性差异(P0.05或P0.01)。活血

15、健脑胶囊组脑缺血/再灌注24hCaspase9 mRNA、Caspase3mRNA表达均减弱, 与模型组比较有显著性差异(P0.01)，与尼莫地平组比较差异无显著性意义(P0.05)。结果见表2、表3、图4、图5。 3 讨论 研究认为各种刺激诱导的细胞凋亡，在细胞凋亡之前出现线粒体膜电位低下，引起膜的通透性增加，膜中存在的50kD的蛋白质AIF（apoptosis inducing factor）向细胞质中漏出，激活非活性的Caspase3使之活化5。电子传递体系中的细胞色素C也从线粒体中向细胞质中漏出，在细胞质中存在的脱氧腺苷三鳞酸（dATP）和凋亡酶激活表1 各组大鼠脑缺血/再灌注后海马C

16、yt C表达比较 统计方法：t检验；.1，与假手术组比较；P0.01，与模型组比较表2 各组大鼠脑缺血再灌注后大鼠海马Caspase3mRNA表达比较统计方法：Ridit 检验；.5，P0.01，与假手术组比较；P0.01,与模型组比较表3 各组大鼠脑缺血再灌注后大鼠海马Caspase9mRNA3 mRNA表达比较（原位杂交，200） Figure 4 Comparison of Caspase3 mRNA expression in different groups (by insitu hybridization,200) a.9 mRNA表达比较（原位杂交，200） Figure 5 C

17、omparison of Caspase9 mRNA expression in different groups (by insitu hybridization,200) 因子1（Apaf1）的作用下，激活非活性的Caspase3使之活化，从而将细胞凋亡的信息传递下去6。另外，氧自由基产生、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙超载、炎症介质的释放皆直接或间接引发线粒体结构和功能的改变及细胞色素C的释放，而这些改变又加重了自由基产生、兴奋毒作用及钙超载7-8。 本实验脑缺血再灌注24h组海马神经元损伤较重,从细胞质到细胞核均发生了严重变化,甚至坏死。随着缺血再灌注时程的增加，线粒体数目减少且明显

18、肿胀,同时,嵴膜表面密度明显减少。应用活血健脑胶囊治疗后，海马神经元的损伤较轻,细胞的超微结构基本正常。而脑缺血2h后再灌注6h至12h未用活血健脑胶囊治疗者则神经元超微结构有一定程度的损伤,可见粗面内质网明显扩张并脱颗粒，核糖体和脂褐素颗粒增多，线粒体肿胀,细胞核周间隙稍增宽，异染色质稍增多，异染色质边聚,说明活血健脑胶囊对脑缺血后神经元损伤具有一定修复作用,特别是对线粒体的保护作用较明显。本实验结果中还发现细胞色素C蛋白在缺血2h后再灌注6h的表达主要在海马CA2区和齿状回区。这一结果验证了脑缺血再灌注后的海马神经元凋亡中线粒体依赖凋亡途径的存在。活血健脑胶囊能明显减轻海马神经元的损伤,细

19、胞的超微结构基本正常,细胞色素C蛋白未见增减变化，这可能是因为活血健脑胶囊能够抑制细胞色素C蛋白从线粒体的漏出，阻断细胞凋亡信号的传递，从而抑制细胞凋亡的发生。 有报道4-5认为在动物脑缺血模型中，应用Caspase3抑制剂治疗可以缩小梗塞体积，延长治疗时间窗。本实验显示应用活血健脑胶囊可降低脑缺血/再灌注后脑组织Caspase3、Caspase9的活性，说明本方可能作用于Caspase3前酶，抑制其激活；或直接作用于Caspase3，从而阻断细胞凋亡的发生。其确切机制有待进一步研究。 【参考文献】 1Shigeno T, Yamaski Y，Kato G, et al. Reduction

20、of delayed neuronal death by inhibition protein synthesisJ. Neurosci Lett, 1990,120(3):177.2Kametsu Y，Osuga S,Hakim A M Apoptosis occurs in the penumbra zone during shortduration focal ischemia in the ratJJ Cereb Blood Flow Metab，2003，23：4163Zamzami N, Hirsch T, Dallaporta B,et al. Mitochondrial implication in accidental and programmed cell death: apoptosis and necrosisJ.J Bioenerg Biomembr, 1997，29(2): 185.4Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occusion without craniectomy in ratsJ. Str