新型生物降解材料PHB细胞相容性研究

1、新型生物降解材料PHB细胞相容性研究汤苏阳艾玉峰董兆麟杨青芳司徒镇强 摘要目的：本文对新研制的聚羟基丁酯（PHB）这一生物可降解材料进行细胞相容性研究。方法：采用L929小鼠成纤维细胞，经材料高温浸提液、常温浸出液与L929细胞接触及直接在PHB膜片上种植该细胞，运用四唑盐比色法（MTT assay）测定其1，3，5天L929细胞的相对增殖率及其毒性程度。结果：PHB材料在高温及常温下物理、化学性质稳定。结论：PHB细胞相容性好，细胞毒性程度0级。 关键词PHB生物降解材料细胞相容性比色法 THE EVALUATION AT THE CYTOTOXITY OF POLY-HYDROXYBUTY

2、RATE AT THE FIBROBLASTS OF MICE IN VITRO Tang SuyangAi YufengDong Zhaolinet al （Chinese PLA 205 Hospital Jingzhou 121000） Abstract Ain：Application of MTT assay to evaluate the cytotoxity of poly-3-hydroxybutgrate at the fibroblasts of mice.Methods：Applicaioh tion logarithmic growth of L929cells of m

3、ice implanting in the different cnditions of PHB to measure the relatie growth rate at 1，3，5 days.Results：PHB is stable at high and normal temperature.Conclusion：PHB have good cytocompatibility and nearly no cytotoxity. Key words Poly- hydroxybutyrate biodegradable materials Cytocompatibility MTT 聚羟

4、基丁酯（Poly- hydroxybutyrate简称PHB）是由微生物产生的聚酯，1927年由法国MLemoigne首次从巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）提取得到。它具有高熔点、高结晶度、高分子量的特点，拉伸程度与聚丙烯大致相同，而且PHB更耐紫外线，不易引起炎症，生物相容性好；由于其由微生物制造，完全不含有重金属等有毒物质，是极洁净的生物塑料1。它在生物体内可以完全降解，它的最终产物是羟基丁酸、二氧化碳和水，因此，可做为新的生物医学材料。英国ICI公司已研制PHB作为无须拆除的外科缝线，商品名为Biopol，该材料在创伤外科、整形外科、美容外科等外科领域及在药学领域

5、方面有着广泛的应用前景，如外科可吸收缝线，软组织植入、骨固定材料、神经修复、抗青光眼手术、药物缓释系统等。 目前国内对于PHB材料的生物相容性研究方面未有报道，本文对新研制的国产聚羟基丁酯进行细胞毒性的实验研究，评价该材料的细胞相容性。 1材料与方法 1.1聚羟基丁酯膜片（500m）二醋酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片，高密度聚乙烯膜片。 1.2浸提液制备 1.2.1高温浸提液的制备将聚羟基丁酯膜片、二醋酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片各2cm2，经过清洁洗涤，75%酒精洗两次，再加10倍量蒸馏水摇洗，两次沥干，加生理盐水20ml，置于121容器中浸提1小时。 1.2.2常温浸出液制备分别将聚-羟基丁酯、二醋

6、酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片用清洁洗涤消毒，分别加入含有10%胎牛血清的RPMI164020ml培养在5%CO2和95%空气、37培养箱内24小时后取出膜片。 1.2.3将聚羟基丁酯膜片、二醋酸二丁基锡析聚氯乙烯膜片、高密度聚乙烯膜片制成大小与96孔板孔底的大小形状一致，制备消毒过程同上。 1.2.4方法将96孔板分成三个区域：区，高温浸提液区；区，常温浸出液区；区，直接接触膜片区。 应用2104个细胞ml L929细胞悬液接种于3块96孔塑料培养板上，每组5孔，每孔100l（区在接种细胞前已置入孔内3种膜片），培养24小时以使细胞贴壁，24小时后进行培养液交换，即区舍弃原培养液加各种50%高温浸

7、提液RPMI1640各100l。区舍弃原培养液分别加各种常温浸出液200l，空白对照组用新鲜的RPMI1640200l交换。区各孔用新鲜培养液RPMI1640200l交换。 然后置入培养箱培养，分别于1、3、5天各取出一块培养板，每孔加入20lMTT溶液继续培养6小时，然后吸出孔内液体每孔加入150l二甲基亚砜，振荡10分钟后，用DG1型酶联免疫检测仪（华东电子管厂）在490nm波长检测光吸收值（OD），取5孔平均值，再通过下列计算相对增殖率（Relative growth rate RGR）2。 RGR实验组吸光值阴性组对照组吸光值100% 最后根据RGR均值按以下评分标准对材料评定毒性程度

8、 评分（score） 相对增殖率（%） 0级 100 1级 75-99 2级 50-74 3级 25-49 4级 1-24 5级 0 2结果 PHB高温浸提液和常温浸出液吸光值及RGR值见表1、表2，在PHB成品上种植L929细胞后的吸光值及RGR值见表3。 表1PHB高温浸提液的吸光值RGR值 材料 浸提液 1日吸光值 3日吸光值 5日吸光值 （高温浸提液） 浓度（50%） S RGR S RGR S RGR （阴） 0.9%生理盐水 0.700.01 100 1.600.07 100 1.840.04 100 PHB 0.720.02 102 1.630.05 101 1.860.03 1

9、01 （阳）Pvc 0.320.03 44 0.480.06 30 0.880.03 48 表2PHB常温浸出液吸光值及RGR评分 材料 浸出液浓度 1日吸光值 3日吸光值 5日吸光值 （常温浸出液） 100% S RGR S RGR S RGR (阴)RPMI 0.880.01 100 2.050.04 100 2.380.05 100 PHB 0.890.01 101 2.070.02 100 2.400.03 100 （阳）Pvc 0.320.01 36 0.780.04 38 1.760.03 48 表3在PHB成品上种植L929细胞后的吸光值及RGR值 材料 1日吸光值 3日吸光值

10、5日吸光值 膜片厚度500m S RGR S RGR S RGR （阴）高密度聚乙烯膜片 0.930.01 100 2.160.02 100 2.510.03 100 PHB 0.960.02 103 2.230.03 104 2.590.04 103 （阳）Pvc 0.380.02 40 0.660.02 30 2.650.03 26 从表1中看出：PHB高温浸提液随着L929细胞培养日数增加，其吸光值也增加，而阳性对照组PVC的毒性稳定，说明高温状态下PHB及成品性能稳定，无毒性浸出物。 从表2看出：PHB常温浸出液PHB随着L929细胞培养日数的增加，吸光值增加，说明常温状态下PHB性能

11、稳定。在常温下无毒性浸出物。 从表3看出阴性对照组高密度聚乙烯膜片稳定无毒性。而PHB上种植L929细胞随着培养日数增加，其吸光值随之增加，说明该材料细胞相容性好，而阳性对照组毒性稳定。 3讨论 3.1关于材料的细胞毒性 生物材料中一些易溶出物质是引起炎症反应和组织反应的主要原因，易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂为研究这些溶出物的细胞毒性。根据ISO7406技术报告选择生物材料应基于： 材料的物理和化学性质的稳定； 没有造成潜在毒性问题的可滤除成份。 在121获得的PHB提取物不产生毒性表明处于高温情况下PHB性质是稳定的，即基本上没有毒性成份浸出，而在常温

12、37 5%CO2、95%空气基本上模拟体内环境，其浸出液的细胞毒性实验说明PHB有较好的生物相容性，对医用植入材料更具有意义。另外，一般来讲受试材料的浸渍程度越高细胞抑制程度越大4，而本实验除高温浸提物为50%浓度外，其余则采取原液，仍表明该材料无细胞毒性。即很好的细胞相容性。 由于直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可测出材料的微弱的细胞毒性5。直接在PHB及成品PHB上接种细胞表明该材料对细胞的生长活性无影响，合乎细胞的生长活力曲线，也说明该材料是无毒性，具有很好的细胞相容性。除此之外，也能看出PVC作为阳性对照具有稳定的细胞素性。是细胞毒性实验的理想阳性对照物6。 3.2关于试验方法

13、目前体外细胞毒性试验的方法很多，各有其不同，但归结起来有： 体外培养所用细胞分成两类，其一为已建株的细胞系，其二为原代培养细胞； 细胞与材料的接触方式可以是直接接触、间接接触或通过材料浸渍液方式接触； 最终的检测指标较为多样，不同的生物学终点（Biological end point）都可以作为细胞损伤的指征。 本实验所采取的细胞毒性评价方法是四唑盐比色法7、8，由于该方法测定生物学终点是重要的细胞器线粒体，而线粒体在细胞生命活动旺盛时增多，衰退时则减少，因此MTT无疑的能灵敏地反应出所测试材料对细胞造成的毒性损害程度，细胞毒性试验已成为常用的检测新的生物医学材料是否具有良好的生物相容性的初筛

14、手段，而本材料通过细胞毒性实验表现出很好的细胞相容性。 现在我们正根据国际标准化组织所推荐的生物试验水平，已开始该材料二期试验，PHB这一新型生物降解材料PHB的各项生物 相容性试验正在进行之中。 本课题受国家863计划(新材料领域)赞助 作者单位：汤苏阳（沈阳军区205医院锦州121000） 艾玉峰（第四军医大学） 司徒镇强（第四军医大学） 董兆麟（西北大学） 杨青芳（西北工业大学） 参考文献 1，郭秀君，于昕.一种型生物塑料（PHB）的研究进展和开发前景.生物工程进展.1997；Vol 17.No.5 2，Park JC.et al.A study of some veribles is

15、a trtrazilium dye（MTT）based assay for cell growth and chemosensitirity.Br.JCancer，1987；56（3）：279 3，张彩霞.应用细胞培养法对复合树指充填材料的毒性研究.口腔医学.1982；2：40 4，Jial sun，Miao xue，Massanoki.kikuchi effects of sr-hydroxyapat-microcrystal on culture ceel 5，梁卫东.细胞培养法评价生物材料生物相容性研究进展.生物医学工程学杂志.1999；16（1）：89 6 Biological Evaluation