细胞培养标准操作程序(SOP)

1、细胞培育标准操作程序（SOP）1目的：为了保证培育细胞的正常生长，试验技术人员必需明确并正确执行细胞培育的基本操作步骤，特制订试验室细胞培育操作流程。2适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培育工作的人员。3操作规程：3.1  培育液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1  1000ml培育液的配制1、预备用品：培育粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、23天内的新颖三蒸水（或新颖反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、23个过滤器、注射器。紫外线照台30min。2、将培育粉用900ml新

2、颖三蒸水（或新颖反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培育基里已含有。4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.27.4生长，配制好后PH值会上升0.20.3，故配时调PH至7.0左右）。5、用新颖三蒸水（或新颖反渗水）定容到1000ml。6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水 

3、0;      溶解 配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水      溶解  取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培育液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培育液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20保存备用。留意：（1）配制培育液及调整培育液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新颖三蒸水（或新颖反渗水）配制。&

4、#160;    一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。（2）预备的100ml×10个玻璃瓶必需事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新颖三蒸水（或新颖反渗     水）的容器均不需高压灭菌，洁净即可。 3.1.2  PBS（平衡盐溶液）的配制 NaCl 8g KCl 0.2g              新颖

5、三蒸水（或新颖反渗水）至1000ml Na2HPO4*H2O 1.56g KH2PO4 0.2g （1） 无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）  （2） Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12 H2O需3.4888g （3） 如欲配制500ml，以上成分减半即可 3.1.3  0.25%胰蛋白酶的配制  

6、; 胰蛋白酶粉          2.5g   EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3g   NaCl                     8.0g       

7、60;   KCl                        0.4g                        

8、;           +新颖三蒸水（或新颖反渗水）至1000ML  NaHCO3              0.5g   Glucose(葡萄糖) 1.0g   酚红            

9、0;          0.06g（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.67.8范围内，故不需调PH值。（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20保存备用。4可连续使用1月左右。（3）用于分装的玻璃瓶必需事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新颖三蒸水（或新颖反渗水）的容器均不需高压灭菌，洁净即可。（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可 3.2  细胞复苏1、预备：紫外线照台30min，预备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培育基临用前放

10、水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培育液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。2、灼烧培育瓶口及瓶盖，用滴管取培育基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。3、戴手套，从-196液氮罐中取出冻存管，马上放入37水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内溶化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培育基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培育基且离心的目的:去除细胞冷冻爱护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色

11、物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培育基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培育瓶里成团，影响细胞生长。5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培育瓶中，标记日期、细胞名称，再把培育瓶放入CO2培育箱。（留意：加入到培育瓶后，培育瓶轻轻平放，用手拿培育瓶侧壁，左右上下轻轻摇摆几次，使细胞均匀贴壁在培育瓶底。）6、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面洁净。 留意：（1）入细胞室前观看CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa！（2）刚复苏的细胞需要的养分成分更多些，让F

12、BS浓度达到20。（3）离心时间为12min，速度为800转，不要离心太久，避开对细胞损害较大。（4）滴管使用留意事项：   a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管肯定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。   b.培育基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！   c. FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,由于血清对胰酶活性有抑制作用。   d胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开（5）不是全部的细胞复苏后都能活。死亡缘由：冻存时间太长（如2

13、年以上），技术不过关（如吹打太激烈）、细胞传代数太多等。（6）关于PBS（平衡盐溶液）:   a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞肯定要插针头。   b. PBS和培育基都可以冲洗培育瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不行经常冲洗细胞。   c不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的预备，使细胞加入胰酶后易消化。   d消化后临时不养细胞的培育瓶，可以往其中加入23ml PBS（防止

14、培育瓶干燥），培育瓶放CO2培育箱里短时间保存。下次用该培育瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培育基冲洗一遍即可再用。（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应准时洗涤冷冻爱护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！ 3.3  细胞换液1、倒置显微镜下观看细胞生长状态：a.移动细胞培育瓶时，观看到呈漂移状态的细胞为死细胞；b.生长状态良好的细胞：透亮度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞微小结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。c.生长状态不良的细胞:

15、0;细胞折光性变弱，轮廓增加，胞质中常消灭空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规章，失去原有特点。d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和试验。2、紫外线照台30min，预备好吸管、试管饭盒，温育培育基，FBS（胎牛血清）可不温。试验开头时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右挨次为：吸细胞液的滴管、吸培育基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培育基，擦干水放入操作台的左边。3、从CO2培育箱中取出细胞培育瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（留意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧。细胞培育瓶倾斜，用吸细

16、胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸洁净。留意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培育瓶内，避开产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！4、用吸培育基的滴管吸取培育基90滴加入到培育瓶（25c）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS 10滴加入到培育瓶中。（使FBS浓度为10）5、旋紧细胞培育瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培育箱中。6、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面洁净。 留意:（1）在打开培育基、FBS（胎牛血清）、培育瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格留意无

17、菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。（2）镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。留意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！（4）培育瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。（5）培育液以没过细胞为宜。（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，简洁增加污染机会。 3.4  细胞计数1、原理：（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。（2）血球计数盘一般有二个cha

18、mbers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。               细胞数/ml4大格细胞总数/ 4×104留意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计

19、算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。2、计数方法：(1) 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘（留意不要溢出，不要有气泡）。(3) 观看计数：压线的记左不记右，记上不登记；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4×）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10×）进行计数。细胞数/ml4大格细胞总数/ 4×104(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干

20、纱布（或干棉签）擦一遍。 3.5  细胞传代1、紫外线照台30min，预备好细胞培育所需物品。2、取灭菌试管1支，配完全培育基（含10%FBS）3ml（培育基:FBS=54滴：6滴）。3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。4、胰酶消化：加入约1ml（20滴）胰酶到培育瓶里消化。胰酶铺平培育瓶底为佳。倒置显微镜下观看培育瓶内细胞，一旦发觉大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培育瓶底，马上用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培育瓶放入CO2培育箱让残存的胰酶连续消化，（在37胰酶消化效果最佳）。5、每1min把培育瓶拿到倒置显微镜下观看，当观看到细胞变圆，透亮，细胞间隙明

21、显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培育基3ml加入到培育瓶中终止消化。6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培育瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽视（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。吹打时尽量避开产生气泡，因其对细胞有损害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有损害。新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次，靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培育瓶中全部细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。7、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培育细胞的阅历，观看多少密度的细胞具体几天可以长满,待有阅历后此步骤可以省略。如需进一步进行铺板则肯定要计数！）8、传代：不同细胞依据

22、细胞数量、生长快慢、难易等，一般依据1：5比例进行传代。先用滴管吹打混匀3ml（60滴）细胞悬液，取12滴细胞悬液到培育瓶中，补足完全培育基（培育基:FBS=9:1）使液体总体积达到4ml，平放到CO2培育箱中连续培育。9、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面洁净。 留意：（1）对于难消化的细胞（如Bxpc-3胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用12ml（即2040滴，或12滴管）4 PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤。（2）肯定要防止细胞过消化！因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞损害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。* 过消化特征：a

23、.在没有加入完全培育基终止消化前就有成团细胞从培育瓶壁上脱落，胰酶里消灭很多悬浮物，为掉下来的细胞。b.培育瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培育瓶底板有一片片空隙。（3）过消化的处理：不吸出胰酶，马上加入3ml完全培育基终止消化后一并收集入试管中，经过800 rpm 离心3min，弃去上清（失活的胰酶、培育基、FBS）。细胞沉淀（白色沉淀物）在试管底，用手指轻弹打散细胞，重新加入适量完全培育基，混匀后放入培育瓶中连续培育。（4）在加入未经37温育的胰酶（指仅为室温）消化细胞时，即使细胞已经变圆，且透亮，用完全培育基终止消化后仍很难吹打下来。那是由

24、于胰酶的温度不适宜；而应当把残留有胰酶作用的培育瓶放到CO2培育箱中，放置5min,让胰酶在其最佳温度(37)下消化细胞。（5）把试管中细胞悬液转移到培育瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细胞成团不均，影响在培育瓶中生长。（6）用力吹打和气泡产生对细胞都有损害，故应轻柔吹打并尽量削减气泡产生。（7）吹打结束使细胞尽量分别成单个细胞为宜。（8）完全培育基为含有10FBS（胎牛血清）的培育液（基）。（9）小牛血清使用范围：520%，10%最常用。血清可把握细胞生长速度，若想减慢细胞生长速度可削减血清浓度，反之亦然。对于刚复苏的细胞需要的养分成分更多些，则血清用20%。（10）一

25、般25c培育瓶需培育液5ml，通常需90滴培育基+10滴胎牛血清（FBS），一滴液体体积为50ul,即20滴为1ml。（11）一般细胞生长铺至瓶底约80%，则可传代或用来做试验，否则细胞进入生长平台期进而缺少养分而状态老化，不易用于后续试验。 3.6  细胞铺板（如12孔板）1、紫外线照台30min，预备好细胞培育所需物品。2、在灭菌试管1中配完全培育基3ml（培育基:FBS=54滴：6滴）3、消化同前，留意防止过消化。吹打混匀计数，如为：8.0×10 5个/ml4、稀释细胞悬液：依据阅历，细胞密度0.8×10 5个/ml较

26、合理，因每孔需加培育液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml（因试管体积有限，6ml即120滴），则配制细胞悬液： 8.0×10 5个/ml ×x ml = 0.8×10 5个/ml × 6ml，x=0.6ml 即   细胞原液： 0.6ml×20滴/ml=12滴完全培育基： 6ml-0.6ml=5.4ml （5.4×20滴=108滴）97滴培育基+ 11滴FBS故取12滴细胞悬液、108滴完全培育液加入试管中。用吸细胞液的滴管吹打混

27、匀细胞悬液。5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，留意无菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按挨次依次滴入。留意：每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀！6、连续稀释细胞悬液6ml，操作同前。7、加完之后，当心平稳地将培育板放入培育箱内，静置5min后，在显微镜下观看细胞是否铺均匀，如不均匀，将影响后续试验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：因孔内细胞悬液1ml，接受700ul枪吹打（不能用滴管，会刮花底面），可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。留意：当心吹打，最好不要起气泡，否则会导致细胞不均，且影响观看。吹打后放倒置显微镜下观看，若不够均匀，连续吹打。将细胞板拿出操作台时需盖板盖

28、，避开污染。8、吹打完毕后，当心将细胞板放CO2培育箱培育。（留意：拿细胞板避开晃动，最好直拿直放，不要推动移动，否则细胞简洁成团。）9、清洁操作台面，用75%酒精喷洒操作台，擦台。 留意：（1）若铺96孔板，则需在96孔板四周一圈孔中加入PBS，防止干燥。              （2）各种不同规格板的铺板细胞数量：  板型细胞密度（孔）体积/孔需细胞数吹打加样枪头6孔板  0.60.8×10

29、 5个/ml 2ml  4×10 41ml12孔板0.60.8×10 5个/ml1ml 68×10 4700ul24孔板0.81.0×10 5个/ml0.5ml45×10 4300ul96孔板  1.0×10 5个/ml   0.1ml     1×10 4 50ul 3.7  细胞冻存1、冷冻前一日前更换半量或全量培育基，观看细胞生