流式细胞术在肿瘤临床和研究中的应用

1、流式细胞术在肿瘤临床和研究中的应用 周永列 1.3免疫分型中的几个问题 白血病免疫分型时尽量选用系列特异性强的单抗作为一线单抗，目前较为公认系列特异性单抗有T系的cyCD3, B系的cyCD79a、cyCD22和髓系的MPO、cyCD13等。一般说胞浆比胞膜的标志特异性强。用此特异性强的标志作为初筛，基本可确定T、 B或髓系，然后再进一步分析。以下为各系列较特别的标志： AML： MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 CDl5、 CDllB、 CDllCT-ALL： cmCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4CD8、 CD38B-ALL： cCD22、cCD79、 CDl9、 C

2、Dl0、 CD24、 HLA-DR、 CD20、 CD38造血干祖细胞CD34、 CDll7、 CD38、 HLA-DR、 ACl33 AML各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考： CD41、 CD61是巨核细胞的标志，见于FAB-M7，但血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。 CD71与血型糖蛋白是红系的标志，见于FAB-M6型。 CDl4、 CD64是单核细胞的标志，见于M4或M5。 FAB-M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3+、 CD33+、 CD9+、 CD38+、 CD34-、 DR-。 t(8；21)M2的表型为 CDl3+、 DR+、 CD34+、 CD

3、33+、 CDl5+、 CDl9+或CD56+。 M0与M1较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆MPO应阴性。 CD34及DR在M0较强，并可伴有CD7与CD4。 CDll7+多见于AML。 CD7常与CD34共表达， CD4见于M4、M5。 CD2+见于M4Eo，往往伴有16号染色体异常。 M3亦可有 CD56+表达。正常粒细跑可表达 CDl0。由此可见，单抗本身有其多向性，勿轻易判断为杂合型白血病。 TB-ALL可分为几个亚型，然而对临床价值不大。但若B-ALL伴有CD34表达时，应进一步作遗传学与基因检测，以确定是否是Ph+ALL，不论是M-bcl/abl或m-bcrablmRNA阳

4、性者，其预后均较差，应接受大剂量化疗或早期接受异基因骨髓移植。 白血病免疫分型是对骨髓或外周血中的白血病细胞进行免疫标记，从而诊断白血病的类型。为此分型时如何提高设门的准确性至关重要。用FCM单参数测定的准确性不高。现今国际上通用的是 CD45SSC设门法，其目的是排除正常细胞的干扰，将不正常的细胞群孤立出来便于重点分析。其原理是CD45是所有白细胞的抗原， CD45表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。红细胞(中、晚幼红细胞、成熟红细胞)不表达 CD45。侧向角光散射(SSC)反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞 SSC最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、 早期造血细胞、红细

5、胞。以 CD45SSC典型图即可获得初步印象。若同时加上一个或二个以上其它单抗进行二、三色甚至四色分析，则很容易识别非正常细胞群的表型，并排除正常细胞的干扰，当标本中幼稚细胞低于50或检测残存白细胞时尤为必要。 是否结合FAB形态学报告值得探讨。 2、流式细胞术检测残存白血病细胞(MRD) 白血病病人在获得血液学缓解后体内还可存在1010以下的白血病细胞。这样少量的细胞常规的显微镜不能测出。在强化治疗和维持治疗后可逐步减少，但难以彻底清除，这是复发的根源。检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及进行异基因骨髓移植时机的依据。 2.1 MRD检测方法的评价 目前已经

6、清楚，残留白血病细胞可以在患者体内存在相当长的时期，随着缓解和治疗时间长短可以出现数量变化，因此应当强调长程动态地而不是孤立单次地监测MRD，从定性水平向定量水平发展。如何从分子水平定义CR，正确评价化疗和骨髓移植治疗的效果? 究竟MRD阴性持续多长时间才算治愈，为什么治疗后仍然长期有MRD? CR患者存在多少MRD细胞才不会影响生存期?这些问题都吸引着白血病工作者的兴趣。可以预计，回答了残留白血病检测和诊断的这些问题，将了解白血病的生物学本质，有助于最终治愈白血病。 3、 白血病的多药耐药 (Multidurg Resistant MDR) 所谓耐药即是肿瘤细胞对细胞毒药物失去敏感性，致使化

7、疗失败。目前研究的热点是多药耐药的发生机制及逆转方法，多药耐药的特点表现在细胞一旦产生对某种药物的耐受性，同时对另外一些在结构和功能上完全不同的药物也产生耐受性，这些MDR相关药物多为一些大分子的天然药物。虽然这种耐药现象的发现是在临床工作中总结的，但是，其耐药机制的研究则是通过在实验室应用药物诱导细胞株细胞或动物模型的耐药表型。主要存在以下几种耐药机制。（1）细胞膜异常表达某些起外排药物作用的蛋白：最早研究并且得到临床证实的是MDR1基因表达产物P-gp蛋白，近年又发现了多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药相关蛋白(LRP)等。（2）细胞内某些酶系统在数量和结构上的异常，研究较多的是谷胀甘肽S

8、转移酶和DNA拓扑异构酶(Topo)。另外还有一些非特异性的细胞氧化和解毒酶系统如P-450、 DNA修复酶、与蛋白磷酸化相关的磷酸化酶PKC等。（3）细胞凋亡(apoptosis)的抑制引起的耐药，这是近年来在耐药研究领域中提出的一个新概念，涉及到细胞凋亡抑制的因子及基因已发现多种，目前在耐药研究中初步观测了bc-2、 c-myc、及P53基因的改变与耐药存在相关性。 3.1多药耐药基因蛋白 （ P-糖蛋白，P-gp）   肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药,即对其他不同类型的多种结构,细胞靶点和作用机理迥然不同的抗癌药物产生耐药,是一种独特的广谱耐药现象. P糖蛋白是一种分子量1

9、70KDa的跨膜糖蛋白(P170)，它具有能量依赖性"药泵"功能。P-gp既能与药物结合,又能与ATP结合,ATP供能,使细胞内药物泵出细胞外,减低了细胞内的药物深度,使细胞产生耐药性。 MDR1 有两种不同的表型，对第一次化疗产生的耐药天然性耐药。在化疗过程中产生耐药的获得性耐药。化疗前MDR高表达的肿瘤,其化疗效果往往不理想 ,化疗前MDR低表达的肿瘤,对化疗有较好的效果,化疗后高表达的肿瘤与肿瘤的疗效及复发有关, 如非何杰金氏病,急淋,慢淋等,有资料报道,复发和难治的白血病其P-gp表达增加. 成人白血病P-gp表达与预后的关系： 据苏州医学院对成人白细胞P-gp检测

10、的报道，以P-gp 10%为阳性，P-gp+的AML完全缓解率明显小于P-gp-的AML，（20.5%VS 78.5%），而在ALL中无显著性差异，P-gp+的ALL，ALL6个月复发率高于P-gp-患者，P-gp+患者的平均无病生存期较P-gp-者短，提示P-gp过度表达是成人AL的不良预后因素，是判断疗效及早期复发的一个重要指标。 成人ALL P-gp表达与形态学、免疫表型的关系：ALL 的P-gp表达与FABL1、L2、L3分型无关，与T、B免疫分型无关，但MY+ALL的P-gp表达明显高于MY-ALL。 AML P-gp表达与免疫分型的关系：成人AML P-gp表达与CD7、CD14、

11、CD42b、CD61、CD34高度相关，老年人AMLP-gp表达与CD14、CD42b、CD61有相关，与CD34高度相关。 3.2 细胞凋亡(apoptosis)的抑制引起的耐药 近年提出化疗药物是细胞凋亡的诱导剂,从这个意义上来说，耐药就是细胞凋亡的抑制。细胞凋亡或细胞程序化死亡与细胞受损伤后的坏死不同，细胞凋亡通常不引起Na、 K、 Ca、Mg 等离子浓度的紊乱及由此产生的细胞肿胀、破碎。最具细胞凋亡特征性变化的是细胞DNA断裂成180-200bp的多个寡核苷酸片段，细胞凋亡不仅在肿瘤发生、细胞损伤反应、抗肿瘤药物治疗、生长因子的应用等方面起重要作用，进一步的研究表明细胞凋亡的发生机制在

12、肿瘤耐药中也起重要作用。许多基因可以调控细胞凋亡，如最早研究的bcl-2、P53、 c-myc等基因。基因转染结果表明，转染bcl-2基因的骨髓细胞对表鬼臼毒素毒性的敏感性明显降低。白血病与bcl-2表达的关系的研究显示，体外实验结果显示5种髓系白血病细胞系的 bcl-2表达与对阿霉素、阿糖胞苛、氨甲蝶吟诱导凋亡的敏感性有关。更多的实验研究显示bcl-2的高表达与白血病细胞对各种诱导剂的高抗性有关，而且这种对化疗药物的不同敏感性受bcl-2表达水平的影响，bcl-2使抗癌药物对细胞的毒性作用变成了对细胞死亡的抑制作用，即bcl-2导致耐药的主要机制是通过抑制肿瘤细胞凋亡途径完成，可以认为这是一种新型的耐药基因。另外，野生型p53基因是细胞凋亡的激活剂，而突变型p53与bcl-2相同都能抑制细胞凋亡，同时也抑制了c-myc基因对细胞凋亡的加强作用，它们共同的作用结果是增加了肿瘤细胞的耐药性。有关细胞调亡的诱导和抑制基因尚有很多，并且还在不断发现新的，仅bcl-2家族就发现7个成员，其中baxbcl-2的比率是影响细胞凋亡的关键，而bcl-2和bcl-xI的二聚体也可促进细胞调亡的发生。它们中的多数对细胞凋亡的作用尚不十分清楚，尤其