抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用的研究_图文

1、抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用的研究王涛,李建东,张全福,李川,刘琴芝,梁米芳3,李德新3(中国疾病预防与控制中心病毒病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京100052摘要:本文报道在内质网和细胞浆内稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体,研究抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用及其抗病毒作用机理。在获得稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系的基础上,用M TT 法检测细胞内表达抗汉坦病毒单链抗体对细胞增殖的影响,证实细胞内抗体的表达不会影响到细胞的生长。不同时间收集病毒感染毒后细胞培养培养上清和细胞裂解物,用EL ISA 方法检测细胞内外病毒结构蛋白含量的变化,结果表明定位于

2、细胞内质肉和细胞浆内的抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体均能不同程度降低感染细胞上清中的核蛋白含量,但是不能或轻微抑制细胞内汉坦病毒核蛋白的合成。利用病毒微量滴定免疫荧光方法,对细胞内抗体与病毒的增殖关系进行了研究,证实无论在内质网还是在胞质,抗核蛋白细胞内抗体都能够抑制病毒的增殖,具有抗病毒活性。抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体不能抑制病毒结构蛋白的合成,其抗病毒效果是通过抑制病毒的包装而实现。关键词:汉坦病毒;核蛋白;抗病毒;细胞内抗体中图分类号:R37313+2文献标识码:A 文章编号:1000-8721(200602-0089-07收稿日期:2005-09-23;修回日期:2006-01-23基金项

3、目:国家自然科学基金项目(编号:30371269作者简介:王涛(1972-,中国疾病预防与控制中心病毒病预防控制所博士研究生。汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属,为分节段的负链RNA 病毒,其病毒基因组由L 、和S 三个片段组成,分别编码病毒多聚酶、包膜糖蛋白G1、G2和核蛋白。汉坦病毒引起的肾综合征出血热主要发生在我国,临床病死率较高,至今没有特异性药物治疗,且抗汉坦病毒感染的机理研究方面尚存在许多欠缺。因此,抗病毒感染机理以及新的治疗途径的研究具有理论和实际意义。细胞内抗体在细胞内特定部位表达,可与靶分子蛋白或多肽结合,直接使其失活或影响靶分子蛋白或多肽在细胞内的合成,运输及各种可能的信号

4、传导,抑制靶分子在细胞内的活性,因而细胞内抗体已成为细胞内蛋白功能、蛋白与蛋白相互作用及信号传导等多种功能的一种新工具,并同时具有临床治疗的应用潜力,故细胞内抗体技术近年来已广泛用于病毒病、肿瘤治疗1,以及心血管疾病、移植及自身免疫疾病2、甚至中枢神经系统疾病3等方面的基础和应用研究。为更好地了解汉坦病毒在细胞内的成熟组装及其病毒结构蛋白在病毒成熟过程中的关键作用和与病毒感染后发病机制的关系,我们构建了分别定位于内质网和细胞浆稳定表达的抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系,感染汉坦病毒后研究其抗病毒作用,为研究汉坦病毒感染的机理奠定了基础。材料与方法1载体与细胞质粒pOPE -101-215(Y

5、ol 为单链抗体表达构建载体,具有pelB 分泌信号序列及3个标签基因:Y ol 2Epitope 为EEGEFSEAR 9个氨基酸残基的Linker 序列、c 2myc Epitope 和6个组氨酸标签,德国海德堡大学Stefan D übel 教授惠赠。真核表达载体p EF/myc/ER 和p EF/myc/cyto 购自Invitrogen 公司,为EF 21启动子携带c 2myc 2Epi 2tope 。其中p EF/myc/cyto 多克隆位点N 端没有分泌及定位信号N 2端以蛋氨酸起始,蛋白合成后分布于细胞浆中,p EF/myc/ER 多克隆位点N 端有定位ER 信号肽,

6、C 端具有ER滞留信号肽SEK DEL ,克隆基因表达后将定位于内质网。Vero 2E6细胞由美国A TCC 引进,本实验室保存,使用代次为1230代。营养液为含有10%小牛血清的DMEM 液,维持液为含2%小牛血清DMEM 液。瞬时表达用COS 27细胞由美国A TCC 引进本室保存,营养液为10%小牛血清的高糖DMEM 培养液。E 1coli XL12blue ,由本室保存,E 1coli DH5,由本室保存1抗汉坦病毒核蛋白单链抗体表达载体pOPE1012L13F3scFv 和pOPE1012H34scFv 本室构建并保存4。2试剂实验用酶购自Biolabs 、Takara 和GIBCO

7、 公司;L IPOFECTAMIN E K it (GIBCO BRL 。FITC 标记抗鼠IgG Fab 特异性抗体,FITC 标记抗人IgG Fab 特异性抗体,TRITC 标记抗鼠IgGHRP 酶标抗人IgG Fab 特异性抗体,第22卷第2期2006年3月病毒学报CHIN ESE JOURNAL OF VIROLO GY Vol.22No.2March 2006HRP酶标抗鼠IgG Fab特异性抗体,HRP酶标抗出血热抗体购自美国Sigma公司。抗鼠anti2myc单克隆抗体购自美国Invitrigen公司。全病毒感染Vero2E6细胞制备的抗原片和汉坦病毒核蛋白抗原由本室自制并保存。

8、3细胞内抗体表达载体的构建及其在细胞内的表达311单链抗体细胞内表达载体的构建细胞内抗体基因来自鼠源汉坦病毒核蛋白组特异性抗体L13F3和人源汉坦病毒型特异性抗体H345。ER2scFv N端有ER信号肽,C端具有ER滞留信号肽SEK DEL,scFvs表达后将定位于内质网。PCR扩增单链抗体基因,分别以52A GG TCC A GC TGC TCG A GT CTGG23,52G A G GTG CA G CTG CTC G A G TCT GGG23为正向引物,单链抗体K appa链可变区3端引物为反向引物分别扩增鼠源L13F3scFv和人源H34scFv。PCR产物经Xho I和Not

9、I酶切克隆入p EF/myc/ ER载体,命名为p EF/myc/ER/L13F3和p EF/myc/ER/ H34,相应的细胞内抗体命名为:L13F32ER和H342ER。cy2 to2scFv没有分泌及定位信号,N2端以蛋氨酸起始,在细胞内表达的scFv将分布于细胞质中,选择Nco I和Not I作为scFv克隆进入位点,可由pOPE1012scFv原核表达载体经Nco I和Not I酶切消化后直接克隆进入p EF/myc/cyto载体,命名为p EF/myc/cyto/L13F3,p EF/myc/cyto/H34,相应的细胞内抗体命名为:L13F32Cyto,H342Cyto。312细

10、胞内抗体在真核细胞内的表达4种载体L IPO2 FECTAMIN E2000法转染24孔板中COS27细胞(操作方法按K it说明书,48h后消化细胞,制备抗原片。IFA检测单链抗体在细胞内的表达,加鼠anti2myc单克隆抗体,37孵育后加荧光素FITC标记抗鼠IgG Fab特异性抗体,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察抗体细胞内表达。4稳定表达细胞内抗体细胞系的建立质粒p EF/myc/cy2 to/AH100,p EF/myc/cyto/Y5,p EF/myc/ER/AH100和p EF/myc/ER/Y5L IPOFECTAMIN E2000法分别转染24孔板中Vero2E6细胞,24h

11、后转种于T25方瓶。24h后,加入终浓度为300g/ml的G418,37,5%CO2培养。培养过程中逐渐加大G418至终浓度为1000g/ml,且细胞长满T25方瓶。胰酶消化细胞,10-510-6稀释细胞,转种于96孔板,有限稀释法进行细胞克隆,建立稳定表达细胞内抗体细胞系。制备细胞抗原片,激光共聚焦显微镜观察抗体细胞内表达。5MTT法检测稳定表达细胞系的细胞活力基本按文献6进行:以每孔103104个细胞接种Vero2E6细胞和上述所建细胞系于96孔板,每孔体积200l,每种细胞8孔,共传4块板,将培养板移入CO2孵箱,37,5%CO2及饱和湿度条件下培养。从第3d开始,每天取一块培养板,每孔

12、加入M TT溶液(5mg/ml20l,37,继续孵育4h,终止培养,小心吸弃培养孔内上清,每孔加入150l DMSO,震荡10min,使结晶充分溶解。测定各孔490nm波长时光吸收值,记录结果。以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。6汉坦病毒染毒实验将稳定表达scFv2cyto和scFv2ER 的Vero2E6细胞系在无G418的DMEM培养液中培养,细胞长满单层后,无血清DMEM培养液冲洗细胞3遍,去掉死细胞。汉坦病毒762118以每个细胞011PFU病毒(011MOI感染细胞,正常Vero2E6细胞设为对照。在37吸附2h,每15 20min轻轻晃动培养瓶,以使病毒吸附均匀。用含2

13、%胎牛血清的DMEM培养基将每瓶细胞冲洗2遍,然后每瓶补加DMEM维持液维持培养细胞。7汉坦病毒结构蛋白的检测及其在V ero2E6细胞中产生的动态观察711汉坦病毒结构蛋白的获得7每天收获病毒感染的Vero2E6细胞培养液,-70冻存待用;收获的感染细胞,弃上清。预冷的PBS洗2遍。加入含015%去氧胆酸钠和011% NP240以及蛋白酶抑制剂的pH715的T ris2HCl裂解缓冲液, 4使细胞充分裂解。将裂解液移入离心管,4,13000r/min 离心15min。收集的上清即含有病毒结构蛋白。712EL ISA夹心法检测病毒结构蛋白动态变化培养上清中病毒N蛋白动态变化:鼠源抗汉坦病毒核蛋

14、白抗体L13F3包被,37封闭1h,加入病毒感染Vero2E6不同天数收获的上清,37反应1h。PBS2T清洗5遍,加入11000稀释于5%脱脂奶的辣根过氧化物酶标记的抗汉坦病毒N蛋白单克隆抗体,37反应1h。显色10min,2mol/L H2SO4终止反应。标检测仪波长490nm测定每孔的吸光度A值,未染毒的空白Vero2E6细胞上清为对照调零。感染细胞中病毒N 蛋白动态变化:单克隆抗体L13F3包被,加入不同天数收获的感染细胞裂解物,检测同上。培养上清中病毒糖蛋白动态变化:单克隆抗体H13211E102121包被,加入不同天数收获的细胞培养上清,371h。加入1:10稀释于5%脱脂奶的人源

15、抗汉坦病毒糖蛋白单克隆抗体Y22,37反应1h,辣根过氧化物酶标记的抗人Fab特异性抗体显色。波长490nm 测吸光度。感染细胞中病毒糖蛋白动态变化:单克隆抗体H13211E102121以1:500包被,加入不同天数收集的感染细胞裂解物,检测同上。8微量法滴定病毒8使Vero2E6细胞在96孔板长成单层。将58d收获的病毒上清用维持液做10-110-8稀释,接种于上述96孔板,每稀释度4孔,每孔011ml。置37,5%CO2培养8d,中间换液1次。将各孔细胞涂片,I2 FA T法检测,计算不同样品TCID50。结果1细胞内抗体在细胞内的表达细胞内抗体在细胞内的瞬时表达4种质粒转染的COS27细

16、胞都能见到目的蛋白在细胞内表达的特异性荧光,其中抗体在内质网分布呈现类似梭状荧光,而细胞浆内表达的荧光则近似指环状,与文献报道一致9,显示目的抗体能够在哺乳动物细胞内定位表达(图1。9病毒学报22卷 图1细胞内抗体在COS -7细胞内瞬时表达免疫荧光定位Figure 1Immunofluorescence localization of intracellular antibodies transientl y expressed in transfected COS 27cell1.L13F32Cyto ;2.L13F32ER ;3.H342Cyto ;4.H342ER.2稳定表达细胞内抗体

17、细胞系的建立四种质粒转染的Vero 2E6细胞经G418及有限稀释法筛选,G418(750g/ml 维持,能见到目的蛋白在细胞内表达的特异性荧光,其阳性率大于95%,表明建立了稳定表达细胞内抗体的细胞系(图2 。图2细胞内抗体在Vero 2E6细胞内稳定表达免疫荧光定位 Figure 2Immuofluorescence localization of intracellular antibodies stably expressed in Vero 2E6cell line1.L13F32Cyto ;2.L13F32ER ;3.H342Cyto ;4.Vero 2E6control.3细胞内

18、表达单链抗体对细胞活力的影响活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够使外源性的MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan 并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜DMSO 能溶解细胞中的紫色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm 波长测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。通过MTT 法检测稳定表达抗汉坦病毒细胞内抗体细胞系的增殖活力,Vero 2E6细胞为对照。结果显示表达单链抗体的细胞系与对照细胞之间的增殖活力差别较小(结果未显示详细的数据。细胞内表达抗汉坦病毒细胞内抗体不影响细胞的生长。4抗汉坦病毒细胞内抗体对病毒结构蛋白合成的影响为了检测抗汉坦病毒细胞内抗体是否具有抗病毒感染活性,我

19、们用汉滩病毒(HTN 762118感染上述所建立的细胞系,通过夹心E L ISA 检测感染细胞内上清病毒结构蛋白的动态变化。用011感染复数(MOI 汉滩病毒762118感染表达抗汉坦病毒细胞内抗体细胞系,在第1天就能够在上清中检测到病毒核蛋白。感染后第3天换液,从第4天开始收集上清并检测。结果显示图3:作为对照的感染汉坦病毒762118株Vero 2E6细胞上清中的汉坦病毒762118N 蛋白在第6d 达到高峰,其后2d ,N 蛋白的变化基本维持在同一水平。所建立的稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系都能抑制上清中汉滩病毒N 蛋白的产生,其中内质网内表达的抗N 蛋白组特异性抗体L13F3

20、2ER 的抑制效果最好,而内质网内表达的抗N 蛋白HTN 型特异性抗体H342ER 效果较差。这种抑制是否为特异性作用,即细胞内表达的抗汉滩病毒抗体是否直接与抗原作用产生上述抑制;或细胞内表达的抗体影响细胞生长或状态导致病毒的复制受到影响,从而产生上述抑制。我们用汉城型(SEO 病毒L99以011MO I 感染抗汉坦病毒核蛋白抗体细胞系,检测收集的病毒培养上清。如图4所示,型特异性抗体H342scFv 无论在内质网(ER 还是在胞质(Cyto 中表达都不能影响上清中N 蛋白的产生;而组特异性抗体L13F3在内质网和胞质中都能抑制病毒培养液中N 蛋白的含量。第9d N 蛋白含量的下降应归因于培养

21、细胞的脱落。证明细胞内抗体与相应抗原特异性结合。192期王涛等:抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用的研究 图3EL ISA 夹心法检测抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系上清中汉坦病毒762118核蛋白的动态变化Figure 3Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain 762118in infected cell line culture stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleocapsid protein intracellular antibodies (by EL ISA 图4EL IS

22、A 夹心法检测抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系上清中汉坦病毒L99核蛋白的动态变化Figure 4Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain L99in infected cell line culture stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleocapsid protein intracellular antibodies (by EL ISA 用011MO I 762118病毒感染所建立的细胞系,细胞内病毒核蛋白变化结果如图5所示:在作为对照的Vero 2E6细胞中,N 蛋白含量依然在第四

23、天达到高峰,并维持在几乎同一水平 。抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系中L13F32ER ,H342ER 对N 蛋白复制的抑制作用很弱,而L13F32Cyto 和H342Cy 2to 几乎不能抑制N 蛋白在细胞内的产生和积累。图5EL ISA 检测抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系细胞裂解液中汉坦病毒762118核蛋白的动态变化Figure 5Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain 762118in infected cell line lysates stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleo

24、capsid protein intracellular antibodies (0.1MOI ,by EL ISA 病毒培养液中糖蛋白含量较低,上清中几乎无法检测。而细胞内糖蛋白含量显著高于病毒培养液中的含量,在细胞裂解液中可检测出糖蛋白的积聚。作为对照,糖蛋白在Vero 2E6细胞中的含量基本处于上升趋势,结果如图6,表达汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系对病毒糖蛋白在细胞内的复制抑制29病毒学报22卷不明显 。图6EL ISA 检测抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系细胞裂解液中汉坦病毒762118糖蛋白的动态变化Figure 6Dynamic changes of the glycoprot

25、ein of HTN virusstrain 762118in infected cell lysates stably expressing anti 2Hantavirus nucleocapsid proteinintracellular antibodies (0.1MOI ,by EL ISA 5抗汉坦病毒细胞内抗体抗病毒活性的检测为进一步明证明病毒增殖与细胞内抗体之间的关系,对病毒培养液中的病毒含量用免疫荧光法(IFA 进行了滴定。如图7所示,作为对照的Vero 2图7荧光微量分析法滴定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系培养上清中病毒滴度Figure 7Detection of

26、 the titers of HTN virus strain 762118in infected cell line culture su pernatant stably expressing anti 2Hantavirus nucleocapsid proteinintracellular antibodies (by IFA E6细胞,其病毒感染后第1d 收获的上清即具有感染力,表明已有病毒包装、成熟、释放。而此时从4种细胞内抗体细胞系收获的上清都不具有感染性,没有成熟的病毒产生。病毒滴度在实验时间内随时间的延长而呈上升趋势,至第8d ,TCID 50可达到106-7/011ml 。

27、与上述糖蛋白产生高峰相吻合。所有表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体细胞系在第5d 和第8d ,其上清中病毒滴度都显著低于Vero 2E6细胞,表明抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体能够部分抑制病毒的复制,具有抗病毒作用。其中,定位于内质网的组特异性抗体L13F32ER 抗病毒活性最强。讨论细胞内抗体是一类在细胞内定位表达,并发挥作用的新型基因治疗抗体。通过研究细胞内抗体对HIV -1结构蛋白、调节蛋白和酶蛋白的作用,证实它能抑制HIV 早期和晚期复制10,11。为了研究汉坦病毒细胞内抗体的抗病毒作用,汉坦病毒的结构蛋白被选择为细胞内抗体作用的靶分子。本实验选择鼠源抗汉坦病毒组特异性抗体L13F3和人源抗汉

28、坦病毒型特异性抗体H34,作为细胞内抗体的源抗体,研究抗体与病毒蛋白的相互作用和细胞内的抗病毒活性。通过M TT 法检测细胞内表达抗汉坦病毒单链抗体对细胞增殖的影响。结果表明,细胞内抗体对细胞产生的毒性极小,并未表现出对细胞的生长和表型的损害。这意味着,此文的实验结果的产生是因为细胞内表达的抗体直接与汉坦病毒相应结构蛋白作用的结果,而不是通过影响细胞的生长而对病毒在细胞中的生命过程产生的间接影响。实验结果显示,相比于Vero 2E6细胞,所建立的在胞质和内质网内稳定表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系都能抑制上清中汉坦病毒N 蛋白的产生。上清中的N 蛋白与病毒的成熟、释放密切相关,是上清中病

29、毒量的标志之一。稳定表达抗汉坦病毒细胞内抗体的细胞系培养上清中的N 蛋白的产生受到抑制,说明成熟、释放的病毒量少于正常Vero 2E6细胞。经典理论认为N 蛋白是胞质蛋白,在病毒的装配过程中N 蛋白的首要功能是与病毒基因组RNA 结合形成核酸核蛋白,保护病毒RNA 免受核酸酶的降解12vRNA 和cRNA 在通过RdRp 复制过程中都需与N 蛋白衣壳化才能完成13,同时N 蛋白还可能调控病毒的复制周期14,在病毒的装配过程中也发挥着重要作用15。定位于胞质的L13F32Cyto ,H342Cyto 在胞质与N 蛋白结合,干扰N 蛋白与vRNA 的结合及普马拉病毒N 蛋白的羧基端93个氨基酸16

30、,H34为型特异性抗体,其作用位点位于C 2端50aa ,可能抑制N 蛋白与RNA 结合。N 蛋白可能直接和G1的细胞浆尾直接作用,起始病毒装配的发生17,L13F32Cyto ,H342Cyto 也可能干扰N 蛋白与G1间的相互作用,阻止病毒的装配。型特异性抗体H342scFv 无论在内质网(ER 还是在胞质(Cyto 中表达都不能影响上清中汉城病毒392期王涛等:抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用的研究94 病 毒 学 报 22 卷 2 Jones S D , Marasco W A. Antibodies for targeted gene t herapy : extracellul

31、ar gene targeting and intracellular expression J . Ad2 vanced Drug Delivery Review , 1998 , 31 : 153 - 170. 3 Lecerf J M , Shirley T L , Zhu Q. Human single2chain Fv intrabod2 ies counteract i n sit u huntington aggregation in cellular models of Huntington s disease J . Proc Natl Acad Sci USA , 2001

32、 , 98 : 4764 - 4769. 4 李建东 , 王涛 , 梁米芳 , 等 . 抗汉坦病毒核蛋白单链抗体的构建 ( SEOV L99 株 N 蛋白的产生 ; 而组特异性抗体 L13 F3 在内质网和胞质中都能抑制病毒培养液中 L99 株 N 蛋白的含量 。证明抗病毒效果是由细胞 内抗体与相应抗原特异性相互作用所导致 。由于传 统理论认为汉坦病毒 N 蛋白不进入内质网 ,则定位 在内质网的 L13 F32ER , H342ER 抗病毒效果明显 ,N 蛋白能够与在内质网内定位表达的 scFv 共定位 ,实 验结果证实这不是由于细胞固定和染色所造成的假 象 ,这是传统理论无法解释 ( 另文发

33、表 。布尼亚病 毒科中 Uukuniemi ( U U K 病毒已明确是在高尔基 体内成熟 , 其 N 蛋白也在高尔基体聚集 18 , H TNV 是否也有类似机制 ,尚未明了 ,我们将在今后对其现 象和机理进行探讨 。 病毒糖蛋白在上清中无法检测 , 表明在病毒培 养液中糖蛋白含量较低 ; 而细胞内糖蛋白含量显著 高于病毒培养液中的含量 , 在细胞裂解液中可检测 出糖蛋白的积聚 , 这与文献报道一致 8 。作为对 照 ,糖蛋白在 Vero2E6 中的含量基本处于上升趋势 , 表达汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞系不能抑制 病毒糖蛋白在细胞内的复制 。 所有表达抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体的细胞

34、系在第 5d 和第 8d , 其上清中病毒滴度都显著低于 Vero2E6 细胞 , 表明抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体 同样能够部分抑制病毒的复制 , 具有抗病毒作用 。 其中 ,组特异性抗体在内质网中表达的 L13 F32scFv2 ER 抗病毒活性最强 。 综上所述 , 该文构建的稳定表达抗汉坦病毒 N 蛋白细胞内抗体的细胞系具有抗病毒活性 , 证实细 胞内抗体在亚细胞结构与病毒蛋白结合 。抗 N 蛋 白细胞内抗体对 N 蛋白在细胞内的合成作用明显 , 其抗病毒效应可能通过抑制病毒的包装和释放而实 现 。研究结果同时表明内质网定位的抗汉坦病毒细 胞内抗体具有明显的抗病毒功能 , 对目前公认的核

35、 蛋白在胞浆合成极其相应病毒组装机理提出挑战 , 病毒核蛋白有可能同时在内质网内合成或通过某种 机制进入内质网 。 参考文献 : 1 Deshane J , Cabrera C , Curiel D T , et al. Targeted eradication of ovarian cancer mediated by intracellular expression of anti2etbB22 single2chain antibodyJ . Gynecol Oncol , 1995 , 59 : 8 - 14. 与表达 J . 病毒学报 , 2003 , 19 : 118 - 122.

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44、ese Center f or Disease Cont rol and Prevention , Beiji ng 100052 , Chi na Abstract :In t his st udy , we have investigated t he potential f unctions of Hantavirus nuclecapsid ( N protein in Hantavirus replication , assembly and mat uration by expression of t he int racellular antibodies to Hantavirus nu2 cleocaps