放射自显影法检测淋巴细胞转化率

1、放射自显影法检测淋巴细胞转化率【目的】本实验以3H-TdR掺入淋巴细胞为例，了解并掌握生物标本细胞涂片放射自显影的制备技术及观察方法。【材料】1消毒肝素抗凝管：每管含肝素1020单位。2PHA（植物血球凝集素）3RPMI 1640培养液：内含20%灭活小牛血清，每毫升培养液中尚含有青霉素100单位，链霉素100 ug。43H-TdR：用时将高比活性3H-TdR用H-ankS液稀释成每毫升740KBq的放射性核素。5瑞-吉氏染液6核4乳胶。7硬化溶液（配方见附录3）8显影液（见附录1）9定影液（见附录2）10玻片、消毒注射器，切片盒，黑纸，香柏油显微镜等。【方法步骤】1静脉抽血2 ml，加至消毒

2、肝素抗凝管内，混匀，置37温箱中静置40分钟。2在无菌条件下将PHA(10 mg)一支以1640培养液2 ml溶化，按每瓶0.2 ml分装于含4 ml培养液的青霉素中。3将0.4 ml外周血贫全血加至上述1640培养液的青霉素瓶中，混匀后置37培养箱培养56小时。4每瓶加3H-TdR 74KBq/0.1 ml继续培养16小时。5终止培养，从温箱内取出不摇动，吸弃上清至专用烧杯内（下同）。6将培养物移入离心管内，以生理盐水反复洗涤、离心二次，每次以1000rpm离心8分钟，弃上清液（同上）7每管加5 ml 0.75 M KCl低渗5分钟，离心同上。8每管加用固定液（甲醇冰乙酸=31） 5 ml固

3、定30分钟并重复一次，每次弃上清，同上，最后一次留0.5 ml制片，自然干燥或置37温箱内干燥，编号。9涂胶：在暗室中取核4乳胶所需量置于一试管内，在3740水浴中溶化，用双蒸馏水作一比一稀释后每毫升乳胶中加100 ul硬化剂，混匀，然后将乳胶涂布于加过温（35左右）的载玻片上。涂布时先用滴管将乳胶滴加于载玻片左侧并使之有余量，再用玻棒向右侧拉满载玻片，使之向前、后、左、右等方向流布均匀，向右后角倾斜，并逐步将载玻片竖起，使多余的乳胶流掉，自然干燥后，将玻片插入切片盒。10曝光：将切片盒用黑纸包好，外套黑塑料袋，置4冰箱内曝光1014天。11显影：曝光后用D196显影液显影（19）515分钟，

4、双蒸水漂洗。12定影：将玻片浸入F5酸性坚膜定影液中，810分钟后流水冲洗1015分钟。13待片干后，以瑞-吉氏染液染色。14镜检：先用低倍镜观察本底及整个涂片情况，然后再以油镜观察有3H-TdR掺入的细胞（胞核上有黑色银粒，一般认为胞核上银粒超过本底3倍以上约10个银粒为转化的淋巴细胞）。附录：（1）D196显影液（适用于薄层核乳胶X线片，幻灯片等）水（50） 500 ml米吐尔 2 g无水亚硫酸钠 72 g对苯二酚 8.8 g无水碳酸钠 48 g溴化钾 4 g加水至全量 1000 ml（2）酸性坚定影液（KodakF-5定影液）水（50） 600 ml海波 240 g无水亚硫酸钠 15 g28%醋酸(冰醋酸3份，加水8份) 48 ml硼酸（结晶） 7.5 g钾矾 15 g加水至全量 1000 ml显影液、定影液在配制时需注意将药品按配方所列前后顺序依以加入，并以前一种药品完全溶解后，再加入后一种药品显影液配制后应放在棕色瓶中，加盖保存在温度较低的地方。（3）