提高农杆菌介导T-DNA转入大豆子叶节点细胞的研究

1、L-半胱氨酸提高农杆菌介导T-DNA转入大豆子叶节点细胞的研究摘要:主要难点在生产转基因大豆大豆(L美林是利用农杆菌介导法,用子叶节点方法将低频的T-DNA 农杆菌转移到子叶节点细胞中去。我们可使农杆菌感染率增加,从37%到91%来自于子叶植节点修改过的共培养地区中,连同半胱氨酸,可使增加了五倍的T-DNA转移到新兴芽原基。南部分析检测比前一个转换效率提高一倍,测定其独立肥沃的数目,转基因植物的接种。组织酶可使褐变外植体减少,这表明半胱氨酸可对带有伤口和致病防御反应的大豆有侵染性、导致T-DNA增加传递到子叶节点细胞中。关键词:农杆菌转化大豆;酶促;褐变伤口和致病防御反应药品:BaP:6-苄-

2、葡聚糖赤霉素;GA3:赤霉素;IAA:吲哚乙酸;MES:乙烷磺酸钠盐;NAA:萘乙酸;PPT:氧磷基1988年Cristou等人使用各种方法转化菌液。然而,大豆的转化仍非常困难。子叶节点(婴儿床节点方法是一种常用的大豆转化体系,将农杆菌介导的T-DNA运送到细胞使其再生,在子叶的茎尖处腋窝淋巴结。但这一转化效率仍然很低, 很显然,只有很少的T-DNA交付在子叶的茎尖腋窝淋巴结上,所以转基因细胞转化效率低,转基因植株再生率低。据报道,现在已经改进了子叶节点转换系统。例如,改进选择性和再生植株的生长。Bolton等人经过不断的努力,用提高农杆菌的致病性来增加化学试剂的诱导基因改善虚拟基因构造。大豆

3、品种筛选和鉴定,Bidney等人用显微投像攻击法或者降解法来增加植物的感染率。可是这些研究方法,显然对改善的子叶节点系统生产转基因大豆植株并没有起到很好的效果。在大豆子叶节点转化体系中,靶位细胞转化,是将5天时间生长出来的子叶,沿着胚轴将其切开,将上胚轴切除,用解剖刀在子叶的节点处制造伤口,但不能超过子叶节点处。下面介绍农杆菌介导的方法,当研究子叶节点转化系统时,我们注意到,在培养时大豆子叶的伤口处,出现了酶促褐变褐组织坏死。大豆子叶是非常容易被病菌感染的,例如Boué等人在2000年发现植物抗生素合成可以引起真菌的出现。在观察大豆子叶褐变时,我们可以假定,大豆子叶伤口的感染可能激活

4、致病防御反应,这就制约了农杆菌介导的T-DNA转移到子叶节点细胞中去。在其它植物体中试图降低褐变和组织坏死的发生,在农杆菌介导方法中已有报道,但不是在大豆中,二硫抗氧剂、聚乙烯可以提高农杆菌介导的转化效率。而半胱氨酸,维生素可以减少组织坏死,用于茎尖农杆菌介导时,Perl铝等人在固体共培养基中加入了葡萄糖等有机物质。由于低下的农杆菌转化效率制约了转基因植物的生产,我们重点时改善,将T-DNA 转移到子叶节点细胞中的方法。在研究调查过程中,我们注意到,在固体培养基中添加L-半胱氨酸,可使农杆菌中更多的T-DNA转移到外植体子叶节点中,从而扩大培养了的转基因大豆植株。材料和方法农杆菌菌株AGL(H

5、ellens and Mullineaux 2000被转化成一个二进制转化质粒bsf16,其中包括抗除草剂自由基因型的bar基因和表现型gus基因。把它们转化到葡萄苷酸酶中,gus基因仅在植物体的序列中表现而不在细菌的序列中表现。CaMV35S基因是由gusA基因和bsf16一起促进构成的。农杆菌的制备农杆菌的制备和子叶节点方法是,农杆菌AGL1首先被应用于YEP的固体培养基中。 pbsf16质粒上的T-DNA结构,从右向左一次为RB,OCS羧合酶,BarPPT基因,P35S CaMV 35S生长基因,PVic生长基因,Ssa向日葵清蛋白基因,TVic基因,gusA基因。GUS基因的使用,(蛋

6、白胨10 g/ L,氯化钠5 g/ L,酵母提取物5 g/L,琼脂1.5 g/L, pH=7.0以及利福平5 g/L、四环素5 g/L、在25 下培养2天,用50 ml的YEP和含有抗生素的培养基,将一个单个群体接种上面,并在25 下振荡培养两天直到饱和。接种的前一天,用3 ml的YEP添加到200 ml的液体YEP,并加入适当抗生素,培养生长温度控制在25 ,直到OD650达到0.8-1.0 。在接种前,取50 ml培养液放入到离心机中,以3270 r/min,离心10 min。使细菌形成一个小的颗粒状为止,将悬浮的细菌放入到含有10%的B5大量、MS铁盐、3%蔗糖、20 mlMES、pH=

7、5.4、B5有机、20微升N-乙酰甲基氨、1.67 ml/L BAP、0.25 ml/L GA3的培养基中。外植体的制备大豆种子大豆(L美林使用氯气灭菌,灭菌后的种子被接种在B5培养基上(B5大量、B5有机、MS铁盐、2%蔗糖、0.8琼脂、pH=5.8 ,3个培养皿一组,将其包裹后放入培养室内,平均温度250C左右,光照强度(90 E/m2s150 E/m2s,光照时间18 h /6 h(光/暗,生长周期为5天-7天,或者直到种子发芽,但一定要在长出第一片叶子之前进行下一步操作。农杆菌那感染每株秧苗根据Hinchee等人的方法,在子叶节点以下用解剖刀可以将大多数的根部和胚轴切除3 mm-5 m

8、m左右。用解剖刀垂直切开子叶下胚轴的地方,可以获得两个被分开的大豆子叶。随后将上胚轴切除,并将腋生胚芽和子叶节点处划伤,用解剖刀垂直下胚轴划10刀左右。将大豆子叶接种到25ml含有农杆菌的悬浮液中。30分钟后,5个一组随意摆放到直径为100x15已灭菌过的培养皿里的滤纸上,并在上面倒一层含浓度为0.5%的琼脂培养基,25 0C下,暗培养5天。GUS的染色、选拔和植株再生5天后,对大豆子叶进行清洗并接种到新的培养基上( B5大量、MS铁盐、3%蔗糖、3 mlMES、pH=5.6、B5有机、1.67 mg/L BAP、100 ml/L 头饱霉素、500 ml/l ticarcillin 接种前要洗

9、去多余的农杆菌。把7个或10个大豆子叶放到一起处理,用( 80 mlNa2HPO4/、8 mlNa2EDTA、0.8%Triton-X、1.6%二甲基化亚矾、20%甲醇、0.38%K4Fe(CN6、1mlX-glucarochasalt、pH=8.0 ,处理后,在37 0C下放置2天,然后将大豆子叶用75%的酒精清洗。选择转芽、接种到诱导丛生芽的固体培养基中(0.8%琼脂含PPT的浓度在(1.33 ml/l、3.33 ml/l、或5.0 ml/l。培养温度在24 0C,光照强度(90 E/m2s150 E/m2s,光照时间18 h/6 h(光/暗。培养14天后,仔细切除上胚轴,然后转到新的发芽

10、培养基中进行次代培养,并放回培养室内,再培养14天。子叶被切除后,愈伤组织需培养28天。然后把愈伤组织转移芽伸长培养基中(MS铁盐、3%蔗糖、3 mlMES、0.8%的琼脂、pH=5.6、B5有机、0.1 ml/L IAA、0.5 ml/L GA3、1 ml/L玉米素、100 mg/L焦谷氨酸、50 mg/L天冬酰氨酸、1.0 mg/L cefotaxime、1.3 mg/L5 mg/L PPT 。这时,一部分大豆子叶用半胱氨酸处理,并将Gus基因着色,切除大约5 mm进行分析,芽伸长后接种倒生根培养基中( MS大量、MS铁盐、2%蔗糖、3 mlMES、0.8%琼脂、pH=5.8、B5有机、5

11、0 mg/L天冬酰氨酸、100 mg/L焦谷氨酸、0.5ml/L NAA 。将T0和T1代放入培养室进行培养、16 h/8 h(光/暗,用1000 W日光灯下进行自然光照。Southern印迹分析依照Sambrook等人的方法提取总DNA。用限至酶EcoRI酶切10ml完整DNA片断,酶切后的DNA在0.8%琼脂糖胶上分离,Southern杂交是依照Sambrook的方法进行的。DNA的转膜、杂交、洗胱可依照Milipore试验手册进行,用限至酶SphI酶切pBSF16质粒载体,产生1.8 kb的片断作为指针,该片断包含gusA编码,片断在1.2%琼脂糖胶上分离,用酚-氯仿法纯化提取,利用PedPrimen随机引物标记系统。在STORM#840中过夜放射投影。试验设计及统计分析转化后5天的大豆子叶随机抽取放置到固体培养基上,包括11个半胱氨酸处理。实验设计是包含7次重复的随机,但实验平均计算根据两个评价系统而来,每个系统又包括两套独立的计算。对数据做方法分析,对每个试验分别计算、处理、评价以及评价的影响。每个试验中心的平均数和LSD也分别计算。结果与讨论为了研究L-半胱氨酸对农杆菌介导T-DNA到大豆子叶节点细胞的转移,我们采用农杆菌转染瞬时表达