增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)及修订说明

1、附件1：增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 动物实验1.1.1 体重1.1.2脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5单核巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验1.1.6 NK细胞活性测定2 试验原则2.1 所列的指标均为必做项目2.2分为正常动物实验方案和免疫功能低下模型动物实验两

2、种方案, 可任选其一进行实验.2.3采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定3 结果判定3.1采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。 在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞活性四个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。 其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，判定NK细胞活

3、性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面的测定。3.2 采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。 其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能试验结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，

4、或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定NK细胞活性结果阳性。血液白细胞总数测定的二个以上剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总数结果阳性。免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。同时在各项实验中，任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。32增强免疫力功能检验方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1. 原理：免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴组织和全身各处的淋巴细胞、抗原呈递细胞等，还包括血液中的白细胞。淋巴细胞经血液和淋

5、巴使各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。胸腺属中央淋巴器官，主要功能是确保T淋巴细胞的产生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬细胞具有清除功能，脾白髓含有记忆B细胞，产生对T依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群，按其表面标志物，分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NK）三大类，T细胞又分为CD4+（Th）细胞和CD8+T淋巴细胞。B淋巴细胞转化为浆细胞后能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能，检测上述免疫系统的各种代表

6、性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。2. 实验动物选择推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，68周龄，1822g（BALB/C种可16-18g），单一性别，雌雄均可，每组1015只。3. 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和1个阴性对照组。以人体推荐量的10倍为其中一个剂量，另设二个剂量组。必要时设阳性对照组。选做免疫低下模型法时，应设模型对照组。受试样品给予时间四周或30天。4免疫功能低下动物模型可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。4.1 造模原理：4.1.1环磷酰胺主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细胞，

7、并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对B细胞的抑制比T细胞强，一般对体液免疫有很强的抑制作用，对NK细胞的抑制作用较弱。4.1.2氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍NF-B进入细胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。氢化可的松还可损伤浆细胞，抑制巨噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用，所以氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。4.2 免疫抑制剂剂量选择环磷酰胺可选择40mgkg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第5天测定各项指标；氢化可的松可选择40mgkg，肌内注射，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项指

8、标。各指标对两种模型敏感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定，建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。4.3 受试物给予连续给予受试物4周或30天，在第3周后开始给予免疫抑制剂，进行模型与预防性给药相结合的实验。5. 实验方法5.1血液白细胞数测定 小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法(仪器法)全血用EDTAK2抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对白细胞进行分分类计数。5.1.1仪器和材料乙二胺四乙酸二钾（EDTAK22H2O，MW404

9、.47），离心管，全血细胞分析仪上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷冻离心机，全血细胞分析仪。5.1.2实验步骤5.1.2.1试剂配制血液抗凝：EDTAK2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，1.52.2mg的EDTAK2可阻止1ml血液凝固。抗凝剂配制：称量8mg EDTAK2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50l抗凝剂可抗凝1ml小鼠全血。5.1.2.2采血 以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。5

10、.1.2.3检测分析 上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作参照仪器说明书。5.1.3数据分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，p0.05，结论：各组均数间差异无显著性意义；F值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。5.2 ConA

11、 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 可任选下列方法之一5.2.1 MTT法5.2.1.1 原理 当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。5.2.1.2 仪器和材料 RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4） 纱布、200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、

12、高压灭菌器、无菌滤器。5.2.1.3 实验步骤5.2.1.3.1 试剂配制完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清， 1谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L）及5105mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌Hanks液 用前以3.5的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液 96mL

13、 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml）无菌Hanks液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3106个/mL。5.2.1.3.3 淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75l ConA 液（相当于7.5g/mL），另一孔作为对

14、照，置5CO2，37CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50l /孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度计上在波长570nm测定OD值。5.2.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：

15、各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。5.2.1.5 注意事项ConA的浓度很重要，浓度过低不能刺激足够的细胞增殖，浓度过高会抑制细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳浓度。5.2.2 XTT法5.2.2.1原

16、理由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，且溶解甲臜的有机溶剂有毒性，可选择XTT法替代MTT法。其原理是：XTT是二甲氧唑黄，在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞线粒体中的脱氢酶可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲臜，生成的甲臜能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶联免疫检测仪检测定吸光值。5.2.2.2实验步骤脾细胞悬液制备同MTT法；淋巴细胞增殖反应：调整细胞浓度为5107，取细胞悬液100l分别加入96孔培养板中，一孔加510l ConA 液，另一孔作为对照，设2个平行孔，置375CO2饱和湿度孵箱中培养72h。培养结束前4h，向各孔中加入2050l的XTT工作液（按试剂盒

17、说明现用现配），孵育4小时。用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。5.2.2.3 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定

18、该项实验结果阳性。5.2.2.4 注意事项细胞浓度及培养时间在实验前要预试，以找到最佳效果。5.2.3 溴脱氧尿嘧啶核苷标记酶联免疫吸附测定法(BrdU-ELISA法)5.2.3.1 原理 T淋巴细胞在有丝分裂原ConA等的刺激下产生增殖反应，BrdU可竞争掺入到增殖细胞中新合成的DNA链内，将BrdU标记的细胞作为抗原结合到固相载体表面，加入酶连接的抗-BrdU抗体，使BrdU抗原与酶标抗体充分结合，抗原抗体复合物与底物作用后产生有色物质，其光密度可反映细胞增殖的程度。5.2.3.2 仪器和材料低温离心机，全自动酶标仪、超净工作台、二氧化碳培养箱、96孔培养板（平底）、倒置显微镜、移液器、手

19、术器械、200目筛网、细胞活性分析仪；RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hanks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）、BrdU细胞增殖检测试剂盒（ELISA）、纯净水、终止液。5.2.3.3 实验步骤5.2.3.3.1 试剂配制完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清，1谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100g/L）及5105mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液

20、，过滤除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌Hanks液 用前以3.5的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。BrdU标记液 将标记剂（试剂盒No.1）按1：100的比例加到培养液中混匀，现配现用。抗体贮存液（母液） 在Anti-BrdU-POD（试剂盒No.3）中加1.1ml双蒸水充分混合，存于-20备用。抗体工作液 每100l抗体母液加10ml抗体稀释液（试剂盒No.4），现配现用。洗液 每10ml清洗缓冲液（试剂盒No.5）加100ml双蒸水。5.2.3.3.2 脾细胞悬液制备 无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞

21、悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为2107个/mL。5.2.3.3.3 淋巴细胞培养将细胞加入96孔培养板中，10l/孔，每份细胞加2孔，第1孔再加入90l1640培养液，第2孔加入85l1640培养液和5.3l ConA，同时设3个空白孔，每孔仅加100l 1640培养液，置5%CO2、37培养箱孵育72h，培养结束前4 h加入BrdU标记液，10l /孔，培养结束后离心（1000r/min,10min）,弃上

22、清，吹干细胞，放4冰箱保存待测。5.2.3.3.4 酶联免疫吸附测定每孔加200l固定液，常温放置30min后,吸弃固定液。加入100l BrdU抗体工作液，37孵育60min；吸弃未结合的抗体，加250l洗液洗3次，轻拍移去洗液。加底物溶液（含TMB）100l /孔，常温孵育15min。用酶标仪测量吸光值，不加终止液时，测定发射波长为370nm（记为A370），参考波长492nm（记为A492）；加终止液时，测定发射波长为450nm（记为A450），参考波长690nm（记为A690）。5.2.3.4 数据处理及结果判定计算每孔标记指数（LI），LI= （A370- A空白370）- （A49

23、2- A空白492）或LI= （A450- A空白450）- （A690- A空白690）。用加ConA孔的LI值减去不加 ConA孔的LI值所得的差值代表淋巴细胞的增殖程度。采用方差分析对标记指数差值进行统计学分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05，则各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的LI值差值显著高于对照组的LI值差

24、值，可判定该项实验结果阳性。5.2.3.5 注意事项选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。5.3 迟发型变态反应（DTH）迟发型变态反应是细胞免疫的体内检测法，当致敏T细胞再次与抗原接触，引起T细胞活化，释放出多种细胞因子，致局部组织发生以单核细胞为主的炎症反应，一般在2448h达高峰。可任选下列方法之一试验。5.3.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）5.3.1.1 原理 二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。47d 后再将其涂抹于耳

25、部进行抗原攻击，使局部肿胀，一般在抗原攻击后2448h达高峰，其肿胀程度可以反映迟发型变态反应程度。5.3.1.2 材料 DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。5.3.1.3 实验步骤5.3.1.3.1 试剂配制 DNFB溶液 DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250l注射器通过瓶盖取用。5.3.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cm3cm、用 DNFB 溶液50l均匀涂抹致敏。5.3.1.3.3 DTH的产生与测定 5天后，用 DNFB 溶液 10

26、l均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。5.3.1.4 数据处理与结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，

27、可判定该项实验结果阳性。5.3.1.5 注意事项：操作时应避免DNFB与皮肤接触。5.3.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）5.3.2.1 原理 SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。5.3.2.2 仪器与材料 游标卡尺（精密度0.02mm）、SRBC、微量注射器（50l）、足趾容积测量仪。5.3.2.3 实验步骤5.3.2.3.1 致敏 小鼠用2(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL（约1108个SRBC）。5.3.2.3.2 DTH的产生与测定 免疫后4天，测量左后

28、足跖部厚度或肿胀度，然后在测量部位皮下注射20(v/v)SRBC，每只鼠20l （约1108个SRBC），注射后于24h测量左后足跖部厚度或肿胀度，同一部位测量三次，取平均值。测量方法：用游标卡尺测量肉眼读数。或用足趾容积测量仪进行测量足跖部肿胀度，操作方法按仪器操作指引进行。5.3.2.4 数据处理和结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数

29、据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值来表示DTH 的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。5.3.2.5 注意事项 前后两次测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。 攻击时所用的SRBC要新鲜（保存期不超过1周）。5.4 抗体生成细胞检测（改良法）5.4.1 原理 溶血空斑试验是检测产生IgM、IgG等抗体分泌细胞数体外试验法。用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见

30、的空斑。5.4.2 仪器和材料 溶血空斑自动图象分析仪、二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、200目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hanks液、RPMI1640培养液、SA缓冲液（C4H4N2O3 0.46g, MgCl2 0.1g, CaCl2.2H2O 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO3 0.252g and C8H11N2NaO3 0.3g, 加蒸馏水至1000mL）、灭菌生理盐水、琼脂糖。5.4.3 实验步骤：5.4.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，生理盐水2500rpm/min，15min，洗涤3

31、次，制备压积SRBC，放入4冰箱保存备用。5.4.3.2 完全培养基的制备：新生小牛血清经绵羊红细胞（v/v，5：1）吸收，4，30-60min后，加入不完全培养基RPMI 1640中，制备成含20%小牛血清的完全培养基。5.4.3.3 补体制备 股动脉取血，静置30-60min，2500rpm/min，15min分离血清，将5-10只豚鼠血清混合后，与压积SRBC以5：1（v/v）比例混合，4冰箱放置30-60min，间或震荡，2500rpm/min，15min分离血清，分装，-80冰箱保存。用时以完全培养基1：10（v/v）比例稀释。5.4.3.4 免疫动物 压积SRBC以生理盐水制成2%

32、（v/v）的细胞悬液（约1108个SRBC），每只鼠腹腔注射0.2mL。5.4.3.5 脾细胞悬液制备 将SRBC免疫4-5天后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpm/min，10min，去上清，Hank液洗2遍，以完全培养基RPMI 1640制备成51061107个细胞/mL的脾细胞悬液。5.4.3.6 空斑的测定5.4.3.6.1 底层培养基制备 0.5g琼脂糖加入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解，待温度于50左右时，以1mL/孔的量加至六孔培养板中，琼脂凝固后备用。5.4.3.6.2 顶层

33、培养基制备 0.5g琼脂糖加入100mL Hanks液中（PH7.2-7.4）,加热溶解，以0.5mL/试管的量加至46-50恒温的试管中。5.4.3.6.3 铺板： 50l 20%SRBC（生理盐水配制，v/v）、200l 脾细胞悬液先后加入含有0.5mL顶层的试管中，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液，每个样本做两个平行孔。5.4.3.6.4 空斑测定：已制备好培养板放入37、5% CO2培养箱中孵育1h，然后每孔加入500l以完全培养基稀释的补体（v/v，1：10），继续孵育2h，自动图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均值为样本的溶血空斑数值，以空斑

34、数/106脾细胞表示。5.4.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。5.5 血清溶血素的测定 可任选下列方法之一。5.5.1 血凝法5.5.

35、1.1 原理 用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。5.5.1.2 仪器和材料 SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机5.5.1.3 实验步骤5.5.1.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。5.5.1.3.2 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥

36、离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。5.5.1.3.3 凝集反应 用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100l，再加入100l 0.5(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37温箱孵育3h，观察血球凝集程度。5.5.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后

37、，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。血清凝集程度一般分为5级（0）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。抗体水平（S1+2S2+3S3nSn）式中1、2、3n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。级

38、 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。5.5.1.5 注意事项 血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。5.5.2 半数溶血值（HC50）的测定5.5.2.1 原理 用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），在补体参与下，与SRBC一起孵育，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。5.5.2.2 仪器和材料 分光光度计、全自动酶标仪、恒温培养箱、96孔培养板、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液（C4H4N2O3 0.46g, MgCl2 0.1g, CaCl2.2H2O 0.2g, NaCl

39、 8.38g, NaHCO3 0.252g and C8H11N2NaO3 0.3g, 加蒸馏水至1000mL）、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）5.5.2.3 实验步骤5.5.2.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。5.5.2.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，70保存。用时以SA缓冲液按18稀释。5.5.2.3.3 免疫动

40、物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min，或6000r/min,4min,收集血清。5.5.2.3.4 溶血反应测定 5.5.2.3.4.1检测方法1（分光光度计测定）：取血清用SA缓冲液稀释（一般为200500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10(v/v)SRBC 0.5mL，补体1mL（用SA液按1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA液代替）。置37恒温

41、水浴中保温1530min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。5.5.2.3.4.2检测方法2(全自动酶标仪测定)：设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清10l,用1mL 1:5稀释的SA缓冲液稀释；每孔加入稀释后的血清100l；空白对照孔：每孔加入100l 1:5稀释的SA缓冲液，再依次加入10(v/v)SRBC 50l，补体100l（用SA溶液或PBS溶液按1:8稀释），置37恒温水浴中保温30min，1

42、500r/min离心10min。然后样品孔和空白对照孔各取上清液50l加入另一个96孔培养板内, 加都氏试剂150l。 同时设半数溶血孔, 加入10(v/v)SRBC 12.5l,再加都氏试剂至200l。用震荡器充分混匀，放置10min后，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。5.5.2.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转

43、换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算： 样品光密度值样品HC50稀释倍数 SRBC半数溶血时的光密度值样品光密度值-空白光密度值或样品HC50稀释倍数 SRBC半数溶血时的光密度值-空白光密度值受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项实验结果阳性。5.6 小鼠碳廓清实验5.6.1 原理 在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系。以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标，两者呈直线关系。此直线斜率(K)可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数a表示。5

44、.6.2 仪器和试剂 分光光度计、全自动酶标仪、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO35.6.3 实验步骤5.6.3.1 溶液配制 注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释34倍。 Na2CO3溶液 取0.1gNa2CO3，加蒸馏水至100mL。5.6.3.2 注射墨汁 称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。5.6.3.3 测定 注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20l ，并立即将其加到 2mL 0.1%Na2CO3溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处

45、死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a： lgOD1-lgOD2K t2t1 体重 3吞噬指数a K 肝重脾重5.6.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的

46、吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。5.6.5 注意事项 静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。 墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。 使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在2030min内不易廓清。5.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验方法5.7.1原理：激活的巨噬细胞具有吞噬表面带有阳性可调理基团的荧光微球，将含有巨噬细胞的腹腔液与调理过的荧光微球孵育一定时间后，去除多余未被吞噬的微球，收集以巨噬细胞为主的标本，用流式细胞仪检测巨噬细胞，计数吞噬荧光微球的巨噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。5.7.2仪器和材料Hanks液，

47、小牛血清，PBS缓冲液，生理盐水，荧光微球(f2mm)， 1小牛血清白蛋白（BSA）。流式细胞仪，超声清洗仪，二氧化碳细胞培养箱，离心机，6孔培养板，细胞刮，过滤器（75mm）,流式上样管，流式细胞仪专用鞘液，移液枪及吸头，白细胞计数板，手术器械一套，注射器，滴管，胶头吸管。5.7.3 实验步骤5.7.3.1试剂配制5.7.3.1.1 含5小牛血清的Hanks液：取10ml小牛血清加入200ml Hanks液中，混匀，临用前配。 5.7.3.1.2 PBS缓冲液的配制方法：KH2PO4 6.66g，Na2HPO412H2O 6.38g，将上述试剂溶于1000ml蒸馏水中调PH值至7.2即成。5

48、.7.3.1.3 2绵羊红细胞悬液的配制方法：实验前取绵羊颈静脉血，置于盛有玻璃珠（20个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动510分钟，除去纤维蛋白，用生理盐水洗涤3次，每次1500rPm，离心10分钟，4冰箱保存。实验前弃去上清，按血球压积用生理盐水配制成2的红细胞悬液。5.7.3.1.4 1BSA的配制：0.5gBSA溶于50mlPBS缓冲液中，临用前配较好。5.7.3.1.5 荧光微球预调理：100l荧光微球与10ml 1BSA 37避光孵育30min, 超声处理5min，临用前配。5.7.3.2 腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球过程实验前4天给每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%绵羊血红细胞

49、激活小鼠巨噬细胞，实验当天用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hanks液3ml/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2ml用75mm过滤器过滤至试管内，调整巨噬细胞数为46105/ml。用移液枪吸取1ml腹腔洗液于6孔培养板中，加入已经预调理过的荧光微球（1107/板），37二氧化碳细胞培养箱（或室温）避光孵育90120分钟，孵育结束后弃上清（含未贴壁细胞和多余荧光微球），每次使用1.0mlPBS缓冲液轻轻洗涤2次，去上清后再加入4PBS缓冲液0.3ml，用细胞刮刮下贴壁细胞，轻轻吹打均匀后经75mm过滤器过滤后上机分析。5.7.3.3

50、流式细胞仪检测分析5.7.3.3.1 设门：首先设立FSC-SSC二维散点图，通过调节FSC和SSC电压值，以巨噬细胞设门界定分析的巨噬细胞群，最大限度地排除其它有核细胞、细胞碎片等的干扰； 5.7.3.3.2 获取：在荧光微球发射光的荧光通路检测巨噬细胞的荧光强度，每份样本获取5000个巨噬细胞，数据可显示于二维散点图和直方图中。在二维散点图中可通过设门圈定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群；在直方图中可通过标尺标定未吞噬荧光微球的巨噬细胞群和吞噬荧光微球的巨噬细胞群，全部数据经相关软件分析未吞噬荧光微球的巨噬细胞和吞噬不同数量荧光微球的巨噬细胞的比例。 吞噬一个荧光微球

51、吞噬二个荧光微球图 1 吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞图(荧光显示400)图2 吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FSC-SSC和FL2-SSC二维散点图R1: 总巨噬细胞群 R2: 未吞噬荧光微球的巨噬细胞群 R3: 吞噬一个荧光微球的巨噬细胞群R4: 吞噬两个光微球的巨噬细胞群R5: 吞噬三个荧光微球的巨噬细胞群R6: 吞噬四个或四个以上荧光微球的巨噬细胞群图 3 吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FL2直方图5.7.4 数据处理及结果判定吞噬荧光微球的巨噬细胞数吞噬百分率（%） = 100 计数的巨噬细胞数 被吞噬的荧光微球总数吞噬指数= 计数的巨噬细胞数以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬

52、细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，XSin -1，式中P为吞噬百分率，用小数表示，然后再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,p0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较，差异均有显著性，可判定该项实验结果阳性。5.7.5 注意事项5.

53、7.5.1 颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管破裂出血，导致腹腔洗液中混杂大量红细胞，影响流式细胞仪的结果分析。5.7.5.2 孵育、细胞洗涤和上机全程注意避光，以保持微球荧光稳定性。5.7.5.3 巨噬细胞、荧光微球浓度要根据试剂说明书调整合适，否则影响结果准确性。5.7.5.4 细胞处理过程要轻柔，尽量减少碎片和杂质对结果分析的影响。5.7.5.5 腹水细胞上机前一定要用足够标准的滤器过滤，调理后多余的荧光微球要尽量去除，以防止流式细胞仪堵塞。5.8 NK细胞活性测定NK细胞是没有T和B细胞表面标志的淋巴细胞，具有非特异性杀伤作用。可任选下列方法之一测定。5.8.1 乳酸脱氢酶（LDH）测定法5.8.1.1 原理 正常情况下，活细胞的胞浆内含有的LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成N