第八章植物体细胞杂交

1、.第八章第八章 植物体细植物体细胞杂交胞杂交第一节第一节 植物体细胞杂交的概念植物体细胞杂交的概念第二节第二节 原生质体融合原生质体融合第三节第三节 杂种细胞的选择和体细胞杂种的鉴定杂种细胞的选择和体细胞杂种的鉴定第四节第四节 细胞质杂种细胞质杂种第五节第五节 原生质体的遗传修饰原生质体的遗传修饰第六节第六节 体细胞杂交的技术的应用体细胞杂交的技术的应用.1 植物体细胞杂交的概念植物体细胞杂交的概念一 植物原生质体融合技术的发展二 植物细胞杂交类型.一 植物原生质体融合技术的发展1 原生质体融合技术发展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1970年，Power首

2、次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体 诱导融合；1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第 一个植物细胞杂种1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应 的融合技术；1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄马铃薯）；1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。.一 植物原生质体融合技术的发展2 植物体细胞杂交（somatic hybridization):

3、 将植物不同种、属甚至科间的原生质体通过人工诱导方法融合，然后进行离体培养再生植株的技术。v1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物体细胞杂种。v19781978年梅尔彻斯年梅尔彻斯(Melchers)(Melchers)等首次获得了番茄和马等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种铃薯的属间体细胞杂种“Potamato”“Potamato”。.去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体融合原生质体融合. 白菜白菜甘蓝甘蓝.3 意义克服有性不亲和性障碍。使丧失形态发生能力的细胞恢复形态发生双亲叶绿体，线粒体DNA重组产生新的核 外遗传系统。.二 植物细胞杂交类型1 植物

4、体细胞杂交类型（1）体细胞杂交 双亲的体细胞原生质体进行融合，培养筛选鉴定，从而获得杂种植株的过程。（2）配子-体细胞杂交 一个为体细胞原生质体，一个为性细胞原生质体，融合获得三倍体植株。.二 植物细胞杂交类型（3）配子间细胞杂交 均为性细胞的原生质体融合，精-精，卵-卵，精-卵原生质体融合。（4）微细胞杂交 诱导细胞产生高频率的微核，分离制备含有微核的原生质体，只携带一条染色体。微小原生质体：只含有细胞核或部分染色体。通过转移单个完整的染色体，建立单染色体添加系，解决细胞杂交出现的难题。.二 植物细胞杂交类型（5）细胞质杂交 受体亲本的原生质体与供体亲本的细胞质杂交，主要改变细胞质遗传，改良

5、叶绿体和线粒体基因组成。细胞质杂交可以缩短育种时间。（6）细胞核的吸收 受体亲本原生质体与供体亲本原生质体细胞核融合，只是供体的核基因转移。.二 植物细胞杂交类型2 原生质体融合类型（1）对称融合：两个完整原生质体的融合，在合子中包含两个亲本全套染色体和部分细胞质。（2）非对称融合：使亲本的细胞质或细胞核失活再融合。 A细胞核B细胞质 A完整细胞B细胞质 A完整细胞B细胞质和部分细胞核.2 原生质体融合原生质体融合一 融合方法二 影响原生质体融合的因素三 融合产物的细胞学.原生质体融合.杂交的两个细胞杂交的两个细胞用纤维素酶、果胶酶处用纤维素酶、果胶酶处理细胞壁理细胞壁原生质体、原生质体、经离

6、心、振经离心、振动、电刺激动、电刺激用聚二乙醇用聚二乙醇（）（）诱导诱导融合后的原生质体融合后的原生质体再生细胞壁再生细胞壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化细胞分裂细胞分裂愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株再分化再分化（植物体细胞（植物体细胞融合完成的标融合完成的标志）志）植植物物细细胞胞融融合合植物植物组织组织培养培养.一一 融合方法融合方法1自发融合自发融合在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体(homokaryon)，每个同核体包含240个核。 形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。 减少自发融合的措施：在用酶液处理之前，使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，

7、切断胞间连丝。 .一一 融合方法融合方法2.诱发融合 （1）NaNO3处理 1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融合。 缺点：异核体(heterokaryon)形成频率不高，对细胞具有毒害作用。.一一 融合方法融合方法（2）多聚化合物法 加入一些多聚化合物如多聚鸟氨酸，改变原生质体表面的物理特性，增强原生质体内吞作用。缺点：可能使细胞膜不可逆破坏。.一一 融合方法融合方法（3）高PH-高浓度钙离子处理 改变膜的通透性，使细胞融合，可以使种间细胞融合。 缺点：但对于有些原生质体系统，这样高的pH值是有毒的。.一一 融合方法融合方法（

8、4）PEG诱导v原理：PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。.一一 融合方法融合方法v特点： 异核体形成的频率高，可重复性强，对大多数细胞低毒；形成双核异核体的频率高。.一一 融合方法融合方法v注意事项：PEG的分子量: (MW 15006000)分子量大融合效果好，但有毒害作用；分子量小，不易诱导融合。使用浓度15%-45%。一年生植物用低分子量，多年生植物用高分子量。酶溶液浓度。原生质体来

9、源。PEG的稀释逐步进行。在PEG溶液中，加入钙离子可以提高融合效率。.一一 融合方法融合方法vPEG融合的技术要点融合剂的配制：A液：氯化钙，磷酸二氢钾，甘露醇，PEG；B液：氯化钙，磷酸二氢钾，甘露醇融合原生质体的密度与比例：105原生质体/mL，比例1:1原生质体融合方式：将原生质体悬浮液均匀地滴入培养皿底部，然后加入融合剂；在原生质体悬浮液滴中间加入融合液A；在原生质体悬浮液顶部加入融合液B。.完整洋葱原生质体（完整洋葱原生质体（4040） 完整烟草原生质体完整烟草原生质体（40）.PEG法原生质体的融合图示法原生质体的融合图示图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合（40） 图二烟

10、草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合PEG法原生质体的融合图示法原生质体的融合图示图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合（40）.一一 融合方法融合方法（5）电融合v原理：在电场中原生质体排列在一起，在高频电流作用下，原生质膜发生可逆击穿，而导致融合，然后细胞膜恢复完整。v优点：对细胞无毒害；融合效率高；操作简单，利用细胞融合仪。v融合参数：交流电压电流强弱，电脉冲大小，处理时间，脉冲宽度，脉冲次数。.两个电极间串珠状原生质体. 细胞电融合仪.二 影响原生质体融合的因素1 原生质体的质量 必须要活力强的原生质体，活力弱在融合过程中导致原生质体死亡。2 融合方法 首先应选择电融合，其次考虑

11、PEG。3 融合参数 PEG法一般考虑PEG的相对分子质量，纯度，浓度处理时间，原生质体的生理状态。电融合主要考虑原生质体密度，融合液的成分，电流强度，脉冲次数和宽幅。.三 融合产物的细胞学v在膜融合以后的数小时内，2个细胞的细胞质混在一起，形成一个双核异核体。 在双亲亲缘关系较近的异核体中，两个核有可能同步进行第一次有丝分裂，而且在这个过程中，二者的染色体被一个共同的纺锤体所牵引，在有丝分裂末期形成两个杂种子细胞。最终分化出体细胞杂种，其核内具有双亲的染色体组。v在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中，两个来源不同的染色体组常常不能完全结合在一起。.3 杂种细胞的选择和体细胞杂种的鉴定杂种细胞的选

12、择和体细胞杂种的鉴定一 原生质体融合产物及杂种细胞发育二 杂种细胞的选择系统三 杂种细胞再生植株的鉴定四 体细胞杂种的遗传特性.一一 原生质体融合产物及杂种细胞发育原生质体融合产物及杂种细胞发育1 原生质体融合产物原生质体融合产物原生质体融合是一个混合体，同核体，异核体，未融合的双亲原生质体。v同核体：细胞质融合，细胞核也融合，形成真正杂种细胞。v异核体：细胞质融合而细胞核未融合，两个细胞核共同存在一个细胞质中。v 不对称杂种：异核体中两个细胞核，若亲缘关系较远，其中一个核中的染色体会被排除掉，形成不对称杂种。v细胞质杂种：细胞质依旧是杂合的，其中一个细胞核完全消失。.一一 原生质体融合产物及

13、杂种细胞发育原生质体融合产物及杂种细胞发育2 杂种细胞的发育动态 v核质重组核质重组v细胞器重组细胞器重组v部分核物质或细胞器丢失部分核物质或细胞器丢失v核分裂的非同步性核分裂的非同步性.一一 原生质体融合产物及杂种细胞发育原生质体融合产物及杂种细胞发育3 体细胞杂种的特点v形态上的趋中性形态上的趋中性 v变异幅度大变异幅度大 v非整倍性非整倍性 v双亲性状的共显性双亲性状的共显性 v偏亲现象偏亲现象.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统1 互补选择系统 根据两个具有不同生理或遗传特性的亲本，在形成杂种细胞时，能产生互补作用，根据这一特性只有发生互补作用的杂种细胞在特定的培养基上才能生长

14、，而淘汰非杂种细胞。（1）激素自养互补选择 两个亲本都需要外源生长素，融合后由于互补作用，能产生内源激素，可以在无外源激素的培养基中生长，采用无外源生长激素培养基可以筛选出杂种细胞。.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（2）叶绿体缺失互补系统 利用叶绿体缺失突变体与野生互补来选择杂种细胞。突变体能生长，野生不能生长，杂种细胞能生长。.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（3）营养缺陷型互补选择 利用营养缺陷型突变体，在有某种营养成分的培养基中不能生长，而杂种细胞起互补作用可以生长。如硝酸还原酶缺陷突变体不能在以硝酸盐作为唯一氮源的培养基中生长，而杂合可以生长。CnX-, nia-

15、.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（4）抗性互补选择系统 利用两个抗性有差异的原生质体，每个亲本对药物敏感性分别被对方的抗性所掩盖。两个单抗亲体融合后会产生双抗的杂种细胞，利用选择培养基可以把杂种细胞选择出来。.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（5）抗光性互补选择系统 利用两个突变体，由非等位隐性基因控制，正常光照生长缓慢，叶色淡绿，经过融合，具有两隐性基因的杂种细胞，经抗光互补，在光照下正常生长。对高光强具有抗性。.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统2 根据物理特性选择（可见标志可见标志）（1）根据可见标志选择 根据不同原生质体具有不同颜色，杂种细胞具有不同颜色，

16、或细胞质状态不同。如：非绿色原生质体与含有叶绿体的原生质体的融合。（半绿半白）.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（2）根据荧光标记选择 将两种原生质体群体分别用不同的荧光染料标记，然后通过荧光显微镜鉴别异核体。（3）应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞。.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统3 组织培养筛选法（1）根据愈伤组织生长差别选择 在曼陀罗和烟草种间体细胞杂交以及在小麦和某些其他禾谷类植物属间体细胞杂交中，发现杂种愈伤组织表现生长优势现象，因此融合处理后只要挑选生长快、长的最大的愈伤组织，就会从中分化出体细胞杂种.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（2）植株再

17、生能力的差别选择 不同来源的原生质体分化再生植株的能力不同。 在体细胞杂交中，只要有一个亲本的原生质体能够再生植株，融合产生的杂种细胞就能再生植株。.二二 杂种细胞的选择系统杂种细胞的选择系统（3）根据生长和分化对培养基要求的差别选择 不同来源的原生质体对培养基成分和激素的要求不同。 设计的培养基只有杂种细胞能够生长。.三三 杂种细胞的再生植株鉴定杂种细胞的再生植株鉴定1 形态学鉴定 体细胞杂交具有两个亲本的形态学性状，通过叶片大小、颜色、花形、株高等，表面毛状体特征进行初步鉴定。.三三 杂种细胞的再生植株鉴定杂种细胞的再生植株鉴定2 细胞学鉴定 染色体数目和形态具有种的特征，融合体细胞染色体

18、会加倍，有不同染色体形态特征。.三三 杂种细胞的再生植株鉴定杂种细胞的再生植株鉴定3 生化分析 主要是同工酶分析，杂种细胞的同工酶表现为双亲的酶带的综和，或出现双亲特有的谱带。.三三 杂种细胞的再生植株鉴定杂种细胞的再生植株鉴定4 分子生物学分析 对杂种细胞进行DNA进行分析，用Southern 印记杂交法和分子标记， 另外对杂种细胞的细胞器DNA进行比较分析，比较叶绿体和线粒体中DNA不同。.四四 体细胞杂种的遗传特性体细胞杂种的遗传特性1 细胞分裂与染色体丢失v分裂几次细胞死亡v发育过程某一亲本的细胞核部分或全部丢失v杂种细胞染色体数目发生变化，细胞质内含物变化。.四四 体细胞杂种的遗传特

19、性体细胞杂种的遗传特性2 基因转移和性状表达v由于染色体丢失，会使一方亲本的部分或个别基因与另一方亲本的染色体发生整合，实现亲本间基因转移，某些性状在后代得以表达。v性状分离相当严重.四四 体细胞杂种的遗传特性体细胞杂种的遗传特性3 体细胞杂种在遗传上不稳定 杂种细胞在遗传上不稳定。原因：亲缘关系的远近，培养过程中的染色体变异，细胞质和细胞核遗传物质的重组。.4 细胞质杂种一 细胞质杂种的概念二 细胞质杂种获得途径三 细胞质杂种的鉴定.一一 细胞质杂种的概念细胞质杂种的概念1 细胞质杂种：原生质体融合时，一方的原生质体只得到另一方的细胞质形成的杂种细胞。胞质杂种(cybrid): 两种来源不同

20、的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起。核质杂种(nucleo-cytoplasmic hybrid): 一个亲本的细胞核与另一个亲本的细胞质基因组结合。.一一 细胞质杂种的概念细胞质杂种的概念2 特点 只有一个亲本的核基因，双亲的细胞质，可以实现对雄性不育性状表达的控制。细胞质雄性不育容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是当前玉米育种中利用的主要类型 .二 获得细胞质杂种的途径常先把异种胞质供体物种原生质体的核灭活，然后再将它与异种胞质受体物种的原生质体融合。紫外照射可以使核灭活。1 一个正常的原生质体与一个失去核的原生质体融合。2 一个正常的原生质体与一个核失活的原生质体融合。3 用原生质体与亚原生质体或微原生质体融合。4 在杂种细胞的增殖过程中，一个亲本染色体丢失。5 用抑制剂处理得到细胞质杂种。.三三 细胞质杂种的鉴定细胞质杂种的鉴定1 叶绿体，线粒体DNA 的分析2 雄性不育性状的表现，光合作用变化，与碳代谢有关的酶类，对抗生素抗性的变化。.5 原生质体的遗传修饰原生质体的遗传修饰一 细胞核移植二 叶绿体移植三 染色体的摄取四 微生物移植.一一 细胞核移植细胞核移植1 细胞核分离（1）方法：匀浆直接从植物组织中分离细胞核，将组织捣碎进行匀加入去污剂，溶解细胞膜，