自身免疫性神经炎未修改

1、自身免疫性神经炎大鼠周围神经病理及电生理变化研究摘要 目的 观察自身免疫性神经炎(EAN)大鼠周围神经的形态学及5电生理功能变化，为自身免疫性周围神经炎的临床提供参考。方法 45 只 SD 大鼠，随机分为 3 组：对照组、模型 1组、模型 2 组，模型组采用 SP26腹腔注射法诱导自身免疫性大鼠模型，分别于诱导造模后 14 天（模型 1 组）及 28 天（模型 2 组）电镜观察尾神经的病理变化，并采用肌电图诱发电位仪检测运动神经传导速度(MCV)、感觉神经传导速度(SCV)，采用放射免疫法检测血清 TNF-、P55 的表达水平变化。结果 模型 1 组及模型 2 组MCV、SCV 低与对照组，模

2、型 2组 MCV、SCV 高于模型 1 组；模型 1 组及模型 2 组 TNF-、P55 表达水平高于对照组，模型2 组 TNF-、P55 表达水平高于模型 1 组，模型 1 组电镜观察可见尾神经脱髓鞘，细胞变性坏死，第 28 天，神经细胞形态较 14 天恢复，细胞5程序性凋亡。结论 EAN 大鼠早期存在着周围神经的脱髓鞘等急性免疫反应损伤，在恢复期损伤仍持续存在，损伤方式以细胞凋亡为主。自身免疫性神经炎；周围神经；细胞；病理；电生理Study to Pathology and Electrophysiology of Peripheral Nerve in Rats with Experim

3、entalAutoimmune Peripheral NeuritisAbstract Objective To observe the change in appearance and physiological function ofperipheral nerve in rats with experimental autoimmune peripheral neuritis(ENS),provide referencefor treatment and preclinical research on autoimmune peripheral neuritis.Methods 24 S

4、D ratswere randomly divided into control groups,first mgroups and second groups,mrats withENS were induced by linear injecting SP-26 in abdominal, pathological change wereobserved with electronmicroscope , motor nerve conduction velocity, sensory nerve conductionvelocity and delitescence electric po

5、tential wave amplitude in coccygeal nerve were weredetected,and lever of TNF-and P55 in serum were measured in 14th days(first mgroups)and 28th days (second groups).Results In comparitons with control groups, MCV and SCV waslower in first mgroups and second mgroups,incomparitons with first mgroups,M

6、CV and SCV was higher in second mgroups; In comparitons with control groups, the leverof TNF-and P55 was higher in first mgroups and second groups, in comparitions with fristgroups,the lever of TNF-and P55 was higher in second groups; demyelination of coccygeal28thnerve and necrosis of Schwann cell

7、were observed in first mgroups,and indays,appearance of cellula nervosa improved and Schwann cell appeared apoptosis.s acuteimmunologic injury occurred in nervus peripheralis of rats with ENS in morning,injury wascontinuous in convalescence stage,but main style of injury was apoptosis.Keywords exper

8、imental autoimmune peripheral neuritis; peripheral nerve; Schwann cell;peripheral; electrophysiology周围神经系统的自身免疫反应引起神经变性及功能改变是综合症、脊髓灰质炎等神经系统疾病的发病机制之一，发病时周围神经系统髓鞘及轴突会发生程序变，导致神经功能下降甚至丧失，引起相关的靶的功能，严重者可引起，近年来，自身免疫反应性神经炎动物模型构建，为自身免疫性神经炎的研究奠定了基础，并初步证实自身免疫性周围神经炎时周围神经炎细胞浸润及脱髓鞘等免疫反应相关性损伤细胞发生变形坏死等病理变化1，但发病不同时期

9、的序贯变化并不明确，我们通过 SP26 一次腹腔注射法构建自身免疫性神经炎大鼠模型，探讨发病不同时期的大鼠周围神经髓鞘的细胞病理变化就及神经的电生理变化，为自身免疫性周围神经炎的研究及临床治疗提供基础。1 材料及方法1.1 试剂及仪器DANTEC Cantata 肌电图诱发电位仪（丹麦 Dantec 公司），Hitachi H-600 透射电子显（日立公司），深低温冰箱（日立公司），DM 多管放射免疫计数器（上海精密仪器厂），戊二醛、磷酸盐缓冲液（南京建成生物工程），乙酸双氧铀、枸橼酸铅染色等（浙江碧云天生物试剂公司），TNF-检测试剂盒、P55 检测试剂盒（北京西塘生物试剂）。1.2 实验动

10、物分组及模型构建45 只 7-8 周龄清洁级 SD 大鼠，体重（100-150g），购自第四实验动物中心，实验动物证号（陕 20080174），实验动物按随机数字表法分为 3 组，空白对照组（15），模型 1 组（15），模型 2 组（15），自由饮水，定量饮食，分笼饲养，保持饲养室 26恒温，适当光照，大鼠饲养 3 周适应环境后采用 SP26 一次注射法构建免疫性神经炎模型，采用 SP26100g？腹腔注射，注射 7 天后，体重下降、尾爪无力、共济失调等症状出现后，按 Conti 等模型构建研究的标准评估，评估未达标者剔出实验组。1.2 电生理检测在模型构建后第7天，分别对对照组及模型1组动

11、物进行周围神经电生理检查，检查前采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物，注射剂量300mg/kg，麻醉后动物固定于实验台，电生理检查采用近神经法，采用DANTEC Cantata肌电图诱发电位仪测定各组大鼠尾神经运动神经传导速度(MCV)、感觉神经传导速度(SCV)及神经动作电位波幅，MCV刺激电极置于尾远端，电极位于其近侧尾根部，相距14cm，参比电极位于其远侧1cm，接地电极位于刺激电极与电极之间，刺激强度3-6mA，MCV（m/s）=电极间距离/潜伏期×波幅, SCV测定方法同前，置换刺激电极与电极位置，刺激强度1-2 mA。在模型构建后第14天测模型2组。1.3 标本及检测大鼠电

12、生理检测完毕后，无菌开胸，剪开心脏，采血4ml，离心后血型保存低温冰箱，顺行切开鼠尾部，钝性分离，提取尾神经，3%戊二醛中固定1小时，冰上固定30min。1.4 切片及染色标本应用-4.0、PH值为7.4、浓度为1%的磷酸盐缓冲液浸泡过夜，0.1%磷酸盐缓冲液冲洗，鹅酸染色脱水，环氧树脂封片，2m连续切片，乙酸双氧铀、枸橼酸铅染色，HitachiH-600 透射电子显观察并照相。1.5 TNF-及P55检测血清标本解溶后，采用放射免疫法检测血清TNF-、P55表达水平，操作严格按照试剂及仪器使用说明书进行。1.6 统计学方法实验数据处理采用 SPSS11.5 软件，统计学方法采用方差分析，组间

13、相关性检验采用pearson 分布，检验水准取 P<0.052. 结果2.1 电生理检查结果同对照组相比，模型组神经电传导速度减慢，在造模后第 7 天，神经传导速度低于对照组，第 14 天，低于第 7 天，第 28 天，神经传导速度高于第 7 天及第 14 天，但低于对照组。表 1 三组大鼠 MCV、SCV 检测结果比较组别NMCV（m/s）SCV(m/s)对照组1416.9±3.2620.4±3.927.6±1.489.9±1.52模型 1 组1213.2±1.9316.4±2.01模型 2 组10注：与对照组相比 P<

14、0.05，：与模型一组相比 P<0.052.2 血清 TNF-、P55 检测结果时间？模型 1 组及模型 2 组血清 TNF-、P55 表达水平高于对照组，模型 2 组血清 TNF-表达水平高于模型 1 组，模型 1 组同模型 2 组 P55 表达水平无显著差异。表 2.2 三组大鼠血清 TNF-、P55 检测结果比较组别NTNF-pg/mlP55(pg/ml)对照组14176.9±32.632.5±7.65294.9±41.263.9±14.2模型 1 组12246.6±42.559.4±15.7模型 2 组10注：与对照组相

15、比 P<0.05，：与模型一组相比 P<0.052.3 周围神经电镜观察结果在 EAN 诱导后第 14 天，电镜观察发现，神经外膜细胞发生变形坏死，失去完整细胞结构，坏死区结构紊乱，在 ENI 诱导后第 28 天，细胞变性坏死减轻，但细胞凋亡等损伤存在。图 1 对照组周围神经切片，电镜下正常的图 2 EAN 模型诱导后第 7 天，电镜观察细胞（形态完整）电镜下坏死的细胞图 3 EAN 模型诱导后第 28 天，神经结构未恢复正常，电镜下细胞表现为固缩凋亡3 讨论自身免疫性神经炎(EAN)是一种周围神经系统病变，其与炎症介质及细胞因子介导的自身免疫反应有关，肿瘤坏死因子（TNF）、CD

16、4+T细胞及巨噬细胞等的众多细胞因子及炎性介质与EAN的发病相关2，介质及细胞因子通过改变Thl/Th2型细胞之间的平衡，上调Thl细胞的作用，激活增殖，导致T细胞免疫的失衡3.4。同时，淋巴细胞、巨噬细胞在周围神经系统、周围集聚，穿过血神经屏障作用于PNS（ ，）。同时，趋化因子高表达5，在趋化因子的作用下，巨噬细胞在局部浸润，剥脱轴突髓磷脂层，导致髓鞘泡状破裂，巨噬细胞吞噬完整的和受损的鞘磷脂，导致小静脉周围大部分轴突产生多发性脱髓鞘病变。周围神经的脱髓鞘是ENS的基本病理变化，细胞作为神经轴突的主要组成部分，对于维持神经的形态及功能具有重要的意义，在SP-26诱导的ENS大鼠可以发现，在

17、造模后14天观察发现，电镜下细胞发生变性坏死，细胞的细胞形态已不可见，局部为坏死组织填充，同时，对SCV、MCV的电生理功能检测也发现，在造模后第14天，SCV、MCV的冲动传导速率降低，说明神经的电生理功能随髓鞘的脱失发生变化，为进一步探讨ENA的病理及电生理程序性变化，在造模后的28天，对上述指标的重复检测发现，外周神经的细胞的形态在第28天仍存在变化，但细胞变形坏死已不可见，部分细胞形态完整、细胞核固缩，表现为程序性细胞凋亡。神经的电生理检测结果表明，SCV、MCV的冲动传导速率较14天时恢复，但仍未恢复正常，细胞作为轴突髓鞘的主要组成成分，在脱髓鞘病变过，既往的研究认为其对神经功形态的

18、影响主要是神经完整性的破坏，是免疫损伤的结果，但是近期的研究表明，在周围神经炎时，细胞能够大量的生物活性物质，参与ENS的周围神经损伤的病理过程，如细胞能够以自方式调节致炎细胞因子或受体的6，表达介质或增强对介质的敏感性，在研究中对TNF-及其受体的P53的检测也发现，在ENA过，TNF-及其可溶性受体P55在大鼠血清的表达水平明显上调，在病理形态恢复期其表达水平也下降，同既往的TNF-水平同周围神经系统病变的预后相关一致，但P55下降的速度较慢，可能与TNF-的刺激持续存在有关，也可能同细胞对介质及受体的调控功能有关，对ENA大鼠的电镜病理、电生理及血清介质的检测结果说明，ENA的发病过，细胞的程序理变化对神经的形态及电生理功能上的影响及对介质的调控作用，是ENA共同的发病机制。参考文献1，等.干扰素-对实验性自身免疫性神经炎治疗作用的组织病理学和免疫学研究J.中国临床神经科学,2006,l4(5):458-4632，治.实验性自身免疫性神经炎相关细胞的免疫机制J.中华神经内科杂志,2006，39（9）：629-6333 Zhu J，Deng GM，Levi M，et a1Prevention of experimental autoimmune neuritisby nasal administration of P2 protein peptid