皮肤敷用的纳米乳剂增加生物利用度

1、皮肤敷用的纳米乳剂增加生物利用度T. Kotyla a, F. Kuob, V. Moolchandani c, T. Wilson a, R. Nicolosi a,摘要本研究的目的是比较敷用的丁型生育酚的纳米乳剂和微米乳剂,因为这涉及到粒子大小和生物利用度。使用七只F1B叙利亚金色的仓鼠分别进行实验,相隔1星期。制备两种乳剂都用到了菜籽油,吐温80、去离子水和丁型生育酚，唯一的区别是在制备纳米乳剂时使用了微流化处理器。都是按配方制成膏状物，敷用在仓鼠刮过皮毛的背部区域。微米乳剂的粒径是2788纳米而纳米乳剂的粒径是65纳米。两小时后，敷用纳米乳剂的仓鼠血浆中生育酚浓度相对基线明显增加了36

2、倍，而敷用微米乳剂的仓鼠只增加了9倍。在敷用3 h后，分别比较的基线，纳米乳剂作用的仓鼠血浆生育酚显著提高了68倍,而敷用微米乳剂的仓鼠血浆生育酚只提高了11倍。分别敷用纳米乳剂和微米乳剂2和3 h后同样观察到显著的差异。这项研究表明纳米乳剂显著提高丁型生育酚透皮敷用的生物利用度。,1 引言维生素E被假设可以减少与氧化应激效应有关的疾病的发病率和严重性，比如实验性的动脉粥样硬化，癌症，慢性炎症和神经紊乱等(Brigelius-Flohe et al., 2002)，因为它具有抗氧化能力。而且,大量证据表明维生素E由于阻止亚硝胺的形成，从而可以减少自发发生的DNA氧化损伤及抑制早期阶段的致癌作用

3、(Ohshima et al., 1982; Azzi et al., 1995; Moore et al.，1999)。其他研究表明，维生素E类化合物对肿瘤及肿瘤细胞的生长有直接的抵抗作用(Kline et al.,2001)。此外，据报道，一些生育酚的同分异构体，尤其是-生育酚,有抗炎症的特性(Grammas et al., 2004; Singh and Jialal, 2004; Singh et al., 2005)，因此，一个可以增强生物利用度和功效的递药系统，比如生育酚对营养制品和药物制剂的医学应用有很大的价值。脂质为基础的纳米剂型是改善药物溶解度和靶向作用非肠胃用药的最佳待选材

4、料(Moghimi and Agrawal, 2005)。纳米乳剂是一类由表面活性剂和水中的油状悬浮物组成的稳定乳剂，粒径通常小于100纳米(Becher, 1983; Porrasa et al., 2004; Sonneville-Aubrun et al., 2004).。报道纳米乳剂的稳定性使它们常常被描述为“接近热力学稳定性”(Tadros et al., 2004).。这表明乳剂系统可以作为溶解性差的药物的配方替代品，如药物如紫杉酚和胺碘酮 (Constantinides et al., 2004)。相对于典型的微米乳剂，纳米乳剂粒径约100 nm的递药系统，能提高多数化合物的生物

5、利用度和有效性的，如消炎药的化合物(Kumar et al., 2004),胰岛素(Yan et al., 2002),破伤风类疫苗(Vila et al., 2005)和双香豆素(Thanos et al., 2003). 对纳米乳剂递药系统的效果的证明来自我们实验室, 相对于微米乳剂的配方（ASF），在微流化处理器上制备的纳米乳剂含有抗氧化剂协同配方(ASF)，显著减少鼠模型的神经母细胞瘤中肿瘤的大小(Kuo et al.,2007)。2材料和方法2.1纳米乳剂和微米乳剂的配方纳米乳剂是由三种物质混合制成：丁型生育酚（西格玛奥德里奇公司,密苏里州,美国)(4.62mg/ml)溶解在10 g

6、菜籽油和10 g吐温80中(西格玛奥德里奇公司,密苏里州,美国)。丁型生育酚和-生育酚被用在该研究中，因为仓鼠体内血流本底水平非常低,从而更容易测定微米乳剂和纳米乳剂作用下生育酚的增加量。加热溶液(50C)，并用电磁搅拌器轻轻地搅10分钟。加热二百四十毫升蒸馏水 (60C)，然后加入到该溶液中。继续搅拌20分钟，使溶液均衡。型号为M-110EH的微流化处理器用来制备丁型生育酚的纳米乳剂（微流体公司，美国）。微流化处理器通过加速产物通过微通道来提供高压力及高剪切速率，使产物快速被磨细到纳米范围。将流体一分为二，以75微米的尺寸高速(50 - 300米/秒)推进微通道。流体喷出微通道时会与反向的流

7、体碰撞，流体在通道里经历了的高剪切率（107 L/s），数量级上优于传统技术。流体碰撞导致亚微粒水平的混合。因此，高剪切率和撞击是导致粒径减小和微流化处理器中多相流体混合的因素。在该研究中，生育酚的纳米乳剂配方以24000psi的压力通过微流化处理器，而制备微米乳剂的配方不经过微流化处理器。2.2 粘度和粒径乌氏粘度计（波士顿，MA，美国）用来测定配方粘度，25C，测定微滴粒径均值，动态激光散射莫尔文纳米仪器测定多分散性指数（粒径分布的宽度）（莫尔文仪器公司，美国）。2.3研究设计七只叙利亚金仓鼠（F1B，菲奇堡，美国）810周年龄的鼠被单独安置在室温20C的笼子里，12h光循环。它们被喂食商

8、业非净化饮食(Ralston Pruina 4001,密苏里州圣路易市,美国)和水。两种乳剂配方分别和低过敏乳膏剂(PCCA,休斯顿,德克萨斯州,美国)1:1混合。所有的鼠在实验前一天都刮过皮毛。在第一天,把1毫升含有乳膏的微米乳剂敷在刮过皮毛的金鼠的背侧区域，涂抹直到看不见为止，记下出血基线的时间，13小时后，在纯CO2 / O2(50/50)气体(Northeast Airgas, Salem, NH)麻醉下收集通过眼窝窦到抗凝测定毛细管的丁型生育酚，并分析浓度。随后的一周，使用含有乳膏的纳米乳剂给上述金仓鼠重复实验，仓鼠被马萨诸塞州大学的洛厄尔的研究办公室(IACUC)指导委员会喂养，实

9、验室动物研究所的实验室资源,国家研究委员会(DHEW出版NO.85 - 23,1985年修订的)。2.4血浆生育酚的分析血浆丁型生育酚浓度测定：添加200µl的血浆与10µ l的视黄醇乙酸酯(国内标准;10µg /ml)和200µl含对甲酚(BHT)(10 mg / L)的乙醇 1.0 ml己烷,然后混合。样本在500×g的离心机中离心5分钟,有机层转移到一个7.0毫升棕色硼硅酸盐瓶中，残留样品用1.0毫升己烷重新提取，有机层与之前提取液合并。在N2蒸发有机层， 加入200µ l含有二叔丁基对甲酚 (10 mg / dL) 的乙醇再次

10、溶解，并注入到高效液相色谱仪中。高效液相色谱系统是一个型号5600 CoulArray的八管道系统，有两个580型泵、高压梯度混合器, PEEK脉冲阻尼器,一个540的自动注射器，调温室和一串连续的八个电量电极(ESA实验室.,切姆斯福德,MA美国)。柱子：3.0 mm×150 mm，3µm Supelcosil LC-18 (色谱科，贝尔丰特，PA，美国)，流动相由甲醇/ 1 m，丙醇/ 1 m，醋酸铵(78:20:2 v / v / v) 以0.8ml/min的速度流动。生育酚的浓度决定于标准化的纯净丁型生育酚 (Sigma Chemicals,圣路易斯,密苏里州,美国

11、)。2.5统计评估 用SigmaStat软件进行统计评估（Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) (Snedecor and Cochouran, 1980) 用重复单向的方差 (RM方差分析)法来分析使用两种乳剂1 - 3 h后基线之间的血浆生育酚浓度。通过方差分析发现统计的有效性，用Student-Newman-Keuls分离法确定差异，Apaired t-test用于分析每一个时间点血浆生育酚浓度，所有的值表示为均值+S.E.M，统计学有效度p < 0.05。3.结果3.1微流化处理器对制备丁型生育酚粒径和浓度的影响丁型生育酚的微米乳剂和纳米

12、乳剂的粒径分别是2788 nm 和 65 nm（图1和图2）,图1中，第三个峰是截止的，因为它超过了莫尔文纳米仪器的测定范围。我们可以假设微型乳剂的真实粒径大于图中所示的2788nm。两种丁型生育酚的起始浓度是4.6mg/ml.图1.微米型丁型生育酚乳剂的动态激光散射粒径分析显示粒子平均粒径2788nm,在0.08 66µm范围波动。图2. 纳米型丁型生育酚乳剂的动态激光光散射粒径分析显示粒子平均粒径65nm在 10200nm范围波动。丁型生育酚的最终浓度在微米级的乳剂配方(4.13毫克/毫升)要高出纳米级的乳剂配方(3.48毫克/毫升)19%。我们之前已经证明损失的丁型生育酚是因为

13、单独通过微流化处理器（图中未显示）。3.2丁型生育酚的微米乳剂与纳米乳剂生物利用度的研究在敷用微米乳剂或纳米乳剂1h后，相对于基线没有观察到明显的血浆丁型生育酚浓度差别（图3）。2h后，使用生育酚纳米乳剂的仓鼠，血浆生育酚浓度相对基线有明显增加（36倍），使用1h后（10倍）（图3）。3h后，敷用丁型生育酚纳米乳剂的仓鼠，血浆浓度相对基线上升（68倍），1h 后（20倍），2h后（0.86倍）（图3）。相比较而言，敷用丁型生育酚微米乳剂的仓鼠，在2h和3h 后生育酚相对于基线分别上升了9倍、11倍。另外，在两组数据中，敷用纳米型生育酚仓鼠的血浆浓度在2h(129%),3h（265%）分别高于使

14、用微米丁型生育酚的仓鼠。4.讨论丁型生育酚纳米乳剂的平均粒径为65nm，而其微米乳剂的平均粒径为2788nm。微米乳剂的第三个峰超过了莫尔文仪器所测定的范围，我们假设它的实际粒径可能要大于我们所得到的数据，粒径的差别可能是使用纳米乳剂比使用微米乳剂生育酚血浆浓度要高的一个主要因素。我们的实验室有更多的证据支持该结论（(Kuo et al., 2007），使用了抗氧化剂协同的纳米乳剂的小鼠，神经母细胞瘤明显下降。在研究中，相对使用了微米乳剂的小鼠，敷用纳米乳剂的小鼠体内肿瘤细胞生长速度明显下降。此外，我们的研究和更早的引证也说明了粒径对几类化合物的生物利用度的影响(Yan et al., 200

15、2; Thanos et al., 2003; Kumar et al., 2004; Vila et al., 2005)。类似的发现也被报到(de Smidt et al., 2004).。penclomedine作为中链甘油三酯，粒径在纳米范围(160720 nm)，配方的粒径在160nm有一个很好的生物利用度。作者提出小粒径的粒子可以渗入更大的范围，有一个更大的表面积的表面吸收，从而成为更有效的递药系统（Seki et al. 2004) 报道说, 相比于300nm的地塞米松棕榈酸酯(DMP) 25 nm的地塞米松棕榈酸酯(DMP)作为活性物质，有效性更好,在不同条件下粒径稳定，药物血

16、浆浓度高，改善其在抗炎部位的分布容积，（Wegmuller et al. (2004)。报道称,铁元素粒径的决定从食物中吸收难溶性铁类物质的难易程度，通过减小铁元素的粒径，可以增加小鼠对铁元素吸收。在目前的研究中假设，比微米生育酚小42倍的纳米生育酚可以增加表面体积比，从而有效的影响生物利用度。局部的施用，纳米乳剂可以增加水溶性差的营养物质和药物的吸收，将其传递到细胞膜，药物释放并作用在皮肤表面，增加药物的皮肤渗透(Paolino et al., 2002)。药物在媒介中的流动性和在其中释放速度及在皮肤表面的渗透性这三个因素决定了经皮渗透的效果。这些因素也影响了药物在皮肤中传递的热力学活性或者在皮肤中的渗透作用，尤其是角质层(Peltola et al., 2003)。小粒径的药物增加角质层的吸收，促进了封装药物/营养渗透进