冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程

1、冻干基因工程a 2a干扰素制造及检定规程本品系用带有人a 2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌， 经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。1菌种1.1菌种来源基因工程a 2a干扰素工程菌由带有人 a 2a干扰素基因的重 组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。1.2菌种特性菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。1.3制造用菌种库的建立从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用 菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库， 但每次只限传 三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。划种LB琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无

2、其他杂菌生长。涂片革兰氏染色在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。对抗生素的抗性应与原始菌株相符。电镜检查应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其 他微生物污染。生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。干扰素的表达量在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。质粒检查应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。表达的干扰素型别应用标准抗a干扰素血清做中和试验，证明型别正确。1.4生产菌种从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种生产菌种的制备及检定取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板23块，培养后挑取平板中510个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分 别进行干扰素表达量测定，至少重

3、复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种 的表达量。1.5种子液从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充 传代，作为罐培养的种子液。2发酵培养2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。2.2发酵培养基应为适于发酵培养的培养基， 根据菌种的抗生素抗性，培养 若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有(3椖邗0防嗫股亍？/P>2.3发酵培养参数根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数3收集菌体用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在 ？/FONT>20C下保存1年。4菌

4、体裂解用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。5制备粗制干扰素菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。6纯化粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。7 加白蛋白取干扰素半成品原液检定合格后， 立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于 ?/FONT>30Co8稀释、除菌过滤将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量1%-2%然后用0.22卩m孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。9分装、冻干9.1 每支安瓿分装1ml,内含a 2a干扰素100或3

5、00万IU9.2 冻干过程制品温度不得超过 33Co9.3 冻干后成品置10C以下干燥处保存，成品检定合格后 进行包装。10半成品检定每批半成品抽样进行10.110.8项检定。启开新菌种生产 的前3批或生产条件有较大改变时进行10.910.12项检定。10.1 效价测定用细胞病变抑制法， Wish细胞/VSV为基本检测系统，用国 家参考品校准为IU o10.2 蛋白含量用Lowry法测定。10.3 比活性应108lumg蛋白。10.4 纯度10.4.1 电泳纯度用非还原型SDS?/FONT>PAG法，加样量不低于5卩g,经扫描仪扫描纯度应在95%上，聚合体不得超过10%1042高效液相色

6、谱纯度用280nm检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。10.5 分子量用还原型SDS?/FONT>PAG法,加样量不低于5卩g, a 2a干扰素分子量应为19KD± 10%10.6 残余外源性DNA含量用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。10.7 残余鼠IgG含量用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20卩g）的鼠IgG含量应在100ng以下。10.8 残余工程菌蛋白含量用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋 白的0.02%。10.9 残留抗生素活性半成品中不应有残余抗生素活性存在。10.10 肽图测定应符合a 2a型干

7、扰素图形，批与批之间图形应一致。10.11 等电聚集测定等电点，a 2a型干扰素等电点应5.76.7范围内。10.12 紫外光谱扫描检查半成品的吸收光谱，批与批之间应一致，a 2a干扰素的最大吸收光谱应为280± 3nm11除菌半成品检定11.1 效价测定同10.1项。11.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行11.3 热原质试验按生物制品热原质试验规程进行，注射剂量按家兔体重 注射20万IU/kg，判定标准按该规程 4.1项要求进行。12成品检定12.1 外观应为白色或微黄色疏松体，另入1ml灭菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可见的不溶物。12.2 pH 值pH值应为6.57.5。12.3 效价测定同10.1项。其效价应为标示量的 80%150%12.4 水分含量应 w 3%( g/g )。12.5 鉴别试验用中和试验法，其抗病毒活性能被抗a 2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。12.6 HBsAg 检测用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定，应为阴性。12.7 无菌试验同11.2项，每批抽样不少于10支。12.8 热原质试验同11.3项。安全试验12.9.1 豚鼠试验用体重300400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml, 观察7天，