细胞划痕实验详细步骤及说明

1、细胞划痕实验的详细步骤及说明细胞迁移(cell migration):也称为细胞移动、细胞爬行或细胞运动，是 指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。它参与到很多生理和病理的活动中，如下：免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一；炎症：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症 部位并发挥其吞噬和组织损伤作用；肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后最常见的活动，如侵入淋巴管、血管后 随脉管系统实现远处转移；损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参 与消炎和凝血；胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的

2、 正常发育。细胞划痕实验的基本原理：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，边缘的细 胞会逐渐进入空白区域使"划痕/伤口 ”愈合。因其类似体外伤口愈合过程，又名 伤口愈合实验(Wound-Healing Assay),广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。细胞划痕实验过程:在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实脸设 定的时间（可有不同时间点），取出细胞培养板，显微镜下观察周边细胞是否迁 至中央划痕区，并拍照。具体实验步骤：1 .培养板划线标记用marke

3、r笔在6孔板背后画横线（用直尺比着），每孔至少穿过5条线， 每条线均匀且平行。2 .细胞铺板在孔内接种约5-10*105个细胞（可根据细胞的生长快慢调整接种数量），原 则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀（细胞铺板均匀技巧可参考往期内 容）。3 .细胞划线第二天用20uL枪头（灭菌）或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标 记线相交。Tips :减少划痕距离的误差办法 不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签； 枪头要垂直，不能倾斜，划痕时可比着直尺； 最好保持力度一致，尽量一次性划完。4 .洗细胞，去除划下的细胞划线完成后，使用无菌PBS洗细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的间 隙肉眼即清晰

4、可见，然后更换新鲜无血清或低血清(<2%)的培养基。Tips :在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞；为了避免细胞数量和状态受到影响，尽量不要用吸泵，可用移液枪缓慢 吸走。5 .细胞培养与观察将细胞放入37C。，5%CO2培养箱中培养。然后在适当的时间点，如0,6. 12, 24小时后取出细胞,在显微镜下观察并拍照。6.数据分析使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。注意事项1,划痕实验一般选择6孔板?因为6孔板大小适中，可保证有相当距离的 平直划痕，便于观察;当然若是需要高通量初筛时，也可以用12或者24孔板。2,细胞的接种密度原则一般是过夜为100%融合，若过夜后细胞未100% 融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐 渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。3,降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响； 一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6, 12, 24h)检测 划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间;如果要单纯考虑细胞迁 移,可以先用丝裂霉素(1pg/ml)处理1h,抑制细胞的分裂。4,确保拍照的观察