螺旋藻多糖对HSV

1、螺旋藻多糖对HSV                 【摘要】 目的 探讨钝顶螺旋藻多糖(PSP)对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的影响及其机制，为进一步开发该药提供理论依据。方法 以不同剂量的PSP作用于HSV-2感染的Vero细胞，应用地高辛标记寡核苷酸探针，检测HSV-2糖蛋白gB mRNA的表达。结果 PSP作用组HSV-2糖蛋白gB mRNA的表达显著低于阳性对照组(P0.01)。结论 PSP抗HSV-2作用的机制之一为抑制

2、HSV-2糖蛋白gB基因的转录。【关键词】螺旋藻多糖；单纯疱疹病毒2型；原位杂交Inhibition of HSV-2 glycoprotein gB mRNA expression by polysaccharide from spirulina platensis(PSP)【Abstract】 Objective To explore the effects and mechanism of PSP on the expression of HSV-2 gB mRNA and to provide a theoretical support for developing new drugs

3、.Methods PSP was applied at various concentrations to Vero cells infected by HSV-2， In situ hybrization was adopted to explore the expression of HSV-2 gB mRNA with digoxigenin(DIG)-labeled HSV-2 oligoprobe. Results HSV-2 gB mRNA were less expressed in PSP treated group than that in the control (P0.0

4、1).Conclusion One of the mechanism of PSP against HSV-2 may be explained by the considerable inhibition of HSV-2 （螺旋藻多糖对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的抑制作用 gB gene trscription.【Key words】 polysaccharide from spirulina platensis; HSV-2; in situ hybrization单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus-2， HSV-2)在人群中感染较为普遍。孕妇生殖器感染可

5、引起早产、流产、死胎、胎儿畸形以及智力低下等，并与子宫颈癌的发生密切相关1，2。近几年研究表明：钝顶螺旋藻多糖（polysaccharides from Spirulina platensis，PSP）是钝顶螺旋藻中具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒和免疫调节作用的重要生物活性物质3，4。我们的前期实验结果表明，PSP有抗HSV-1的作用，但PSP抗HSV-2的实验研究未见报道。本文研究了PSP对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的抑制作用，结果报告如下。1 材料与方法 1.1 药品与试剂配制 螺旋藻多糖：参照文献5，6，采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻多糖，纯度达92以上。以双蒸水配成10mg/

6、ml母液，过滤除菌，分装，4保存，临用时以DMEM培养基稀释至所需浓度。 细胞培养所用的DMEM干粉培养基为美国GIBCO公司产品，胰酶为Amersco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品；地高辛DNA检测试剂盒为Roche公司产品。1.2 细胞株与病毒 非洲绿猴肾细胞Vero细胞株为本室保存传代细胞系。于DMEM基础培养液中加入10%的新生牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml链霉素，置5CO2孵箱中37培养，3天传代1次。标准单纯疱疹病毒2型（HSV-2）333株来源于中国协和医科大学，Vero细胞中传代，毒种保存于-70。 1.3 病毒滴度的测定 以TCID50表示病毒毒力。取

7、上述制备好的毒株，做10倍系列稀释，10-1至10-10。将各稀释度的毒株接种于Vero细胞，各6复孔，同时设阴性对照。37培养3天后，观察细胞病变，以出现细胞病变的最高稀释倍数的倒数作为TCID50。1.4 原位杂交检测HSV-2糖蛋白gB mRNA的表达 探针的设计7，8 根据Gen Bank中HSV-2 全基因序列，设计对应于HSV-2糖蛋白gB基因序列的寡核苷酸探针序列为5-ggcgactttgtgtacatgtccccgttttacggctaccgg -3，由上海生工公司合成，并于5末端标记地高辛。 原位杂交9 Vero细胞制成2×105/ml细胞悬液，接种在放有盖玻片（飞

8、片）的培养板中，每孔加入1.8ml细胞，于5CO2孵箱中37培养2448h，弃生长液，加约100 TCID50病毒液50l，37吸附2h，吸出病毒液，加200l不同浓度的PSP（100g/ml、50g/ml和10g/ml）， 置5CO2孵箱中37培养。24h后，取出细胞飞片经4%多聚甲醛室温下固定20min，PBS漂洗2次，梯度乙醇脱水，蛋白酶K（1g/ml）37消化30min，PBS漂洗2次，2×SSC洗2次，梯度乙醇脱水，空气干燥。每张飞片滴加50l 杂交液，预杂交2h；加入含探针的杂交液，置于密闭湿盒中，60过夜。杂交结束后，飞片在室温下依次经2×SSC、1×

9、;SSC、0.5×SSC漂洗各2次，于Buffer洗液中10min，封闭液Buffer中37孵育30min，加入抗体液37孵育3060min，Buffer洗液中10min，置Buffer平衡10min，新鲜配制的显色液中避光孵育10min至数小时，终止提 （，。）反应。中性树胶封片。实验同时设3个阴性对照：(1) 杂交前用Rnase A 100g/ml预处理细胞飞片，37，1h；(2) 加未标记的探针进行反应；(3) 正常的Vero细胞。阳性对照为未加PSP作用的HSV-2感染Vero细胞组。所有操作步骤与其他样本相同。结果判定：400×光镜下随机选择视野，观察200个细胞

10、，计数杂交阳性的细胞数。阳性信号呈明亮的蓝紫色。1.5 统计学方法 核酸杂交结果以(x±s)表示，多组数据比较采用方差分析。2 结果光镜下观察原位杂交结果，可见表达HSV-2糖蛋白gB基因的Vero细胞被染成蓝紫色，染色部位位于细胞浆，而正常Vero细胞未见阳性信号表达（图1）。不同剂量PSP作用的HSV-2感染组，其糖蛋白gB mRNA的表达显著低于阳性对照组（P0.01），10g/ml、50g/ml、100g/ml PSP可使gB mRNA的表达由86.61%分别降至62.29%、46.12%和31.56%（表1）。 1 闻玉梅. 现代医学微生物学.上海: 上海医科大学出版? （

11、螺旋藻多糖对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的抑制作用(3) 纾?1999，1227-1244.2 Whitely RJ， Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet，2001， 357:1513-1518.3 涂芳， 杨芳， 郑文杰，等. 螺旋藻多糖的研究进展. 天然产物研究与开发， 2005， 17（1）: 115-119. 4 于红，张学成. 螺旋藻多糖抗HSV-1作用的体外实验研究. 高技术通讯，2002，12(9):65-69. 5 Lee JB， Hayashi T， Hayashi K， et al. Further p

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