血管性痴呆大鼠脑内超微结构变化及生长抑素和nNOS的表达

1、血管性痴呆大鼠脑内超微结构变化及生长抑素和nNOS的表达                          作者：宋志宇 卢宏 孙玉华 魏建科 谭岩 方艳秋【摘要】  目的 研究血管性痴呆(VD)大鼠生长抑素(SS)、一氧化氮合酶(nNOS)的变化，探讨两者与认知功能的关系。方法 将30只1415 w龄大鼠随机分为假手术组(SOG)和模型组(MDG

2、)，MDG组采用双侧颈总动脉丝线结扎方法，制备慢性前脑缺血动物模型，SOG组仅分离双侧颈总动脉，但不阻断血流。应用水迷宫实验测试大鼠空间学习记忆能力，应用透射电镜观察大鼠神经元超微结构变化，应用免疫组化方法检测海马及颞叶皮层SS及nNOS的表达情况。结果 水迷宫实验中MDG组大鼠的逃避潜伏期(69.70±4.77)s较SOG组(12.93±2.77)s明显延长(P<0.05)，MDG组大鼠的跨平台次数(1.80±1.31)较SOG组(8.33±1.30)明显减少(P<0.05)。透射电镜观察，海马神经元高度水肿，核固缩或崩解，线粒体肿胀。免疫

3、组化结果表明，海马区SS的表达MDG组(3.07±1.44)较SOG组(13.73±1.87)明显下降(P<0.05)，颞叶皮层区SS的表达MDG组大鼠(2.73±0.96)较SOG组(12.93±1.67)明显下降(P<0.05);海马区nNOS的表达MDG组大鼠(29.60±2.03)较SOG组(9.33±1.63)明显增加(P<0.05)，颞叶皮层区nNOS的表达MDG组大鼠(28.87±2.47)较SOG组(8.40±1.64)明显增加(P<0.05)。结论 VD大鼠学习记忆能力降低

4、，脑内超微结构变化明显，脑内SS表达水平下降、nNOS表达水平增高。 【关键词】  血管性痴呆;水迷宫实验;透射电镜;生长抑素;一氧化氮合酶【Abstract】 Objective To study the changes of the somatostatin (SS), nitric oxide synthase (nNOS) of thevascular dementia (VD) rats, and to explore the relationship between them and the cognitive function. Methods 30 1415month

5、old rats were randomly divided into sham operation (SOG) and model groups (MDG), MDG group was ligated bilateral carotid artery by thread to prepare for the animal model of the chronic front cerebral ischemia. SOG group was only separated bilateral main carotid artery, but was not blocked the blood

6、flow. Water maze test was used to test the abilities of spatial learning and memory of the rats. The transmission electron microscope was used to observe ultrastructural changes in rat neurons; immunohistochemical method was adopted to detect the SS and nNOS expressions in hippocampus and temporal c

7、ortex. Results In the water maze test, the escape latency of the MDG rats (69.70±4.77)s was significantly longer than that of SOG group (12.93±2.77)s, P<0.05，the number of crossplatform of MDG rats (1.80±1.31) was decreased significantly compared with that in SOG group (8.33±1

8、.30), P<0.05. TEM observation showed that there was high degree of edema in hippocampal neurons, karyopyknosis or collapse, and mitochondrial swelling. Immunohistochemistry results showed that the expression of SS in hippocampus was decreased significantly in MDG group(3.07±1.44)compared wit

9、h that in SOG group (13.73±1.87), P<0.05, the expression of SS in temporal lobe was decreased significantly in MDG group(2.73±0.96)compared with that in SOG group (12.93±1.67), P<0.05 , the expression of nNOS in hippocampus was increased significantly in MDG group(29.60±2.0

10、3)compared with that in SOG group (9.33±1.63), P<0.05, the expression of nNOS in temporal lobe was increased significantly in MDG group(28.87±2.47)compared with that in SOG group (8.40±1.64), P<0.05. Conclusions The abilities of learning and memory of VD rats with are reduced, a

11、nd the ultrastructure in the brain are significantly changed, the level of SS in the brain is decreased, the nNOS expression is increased.     【Key words】 Vascular dementia;Water maze test;Transmission electron microscopy; Somatostatin;Nitric oxide synthase 血管性痴呆(vascular dementi

12、a，VD)发病机制尚不十分清楚，目前尚无有效方法和药物控制病程进展。根据文献报道，大鼠双侧颈总动脉结扎能造成大鼠明显的学习记忆障碍1。本文通过双侧永久性结扎老龄大鼠颈总动脉，建立VD动物模型，观察VD大鼠学习记忆能力、海马神经元的结构以及海马、颞叶皮层生长抑素(SS)及一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞的表达情况，探讨VD的发病机制。1 材料与方法1.1 动物模型的制备 SD大鼠30只，体重约450550 g，1415 w，由河南省实验动物中心提供。将SD大鼠随机分为模型组(MDG)及假手术组(SOG)。MDG组根据Olsson方法2，术前12 h禁食、6 h禁水。10%水合氯醛(0.30 ml/

13、100g)腹腔注射麻醉，颈前部去毛，消毒后沿腹侧颈正中切开，气管旁分离出双侧颈总动脉，以“0”号线双重结扎颈总动脉。SOG组动物行颈前切开，分离但不结扎颈总动脉。1.2 大鼠空间学习记忆能力测试(Morris水迷宫)3 分为定位航行实验及空间搜索实验两部分。定位航行实验：实验历时5 d，第1天让大鼠自由游泳2 min;从第2天起，每天分上、下午两段，每段训练4次，每次训练间隔为60 s。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠寻找并爬上平台时所需时间(即潜伏期)。如果大鼠在120 s内未找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期计为120 s。空间搜索实验：在第5天最后一次训练后撤

14、除水下平台，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，测其在120 s内跨过原平台相应位置的次数。术后61 d按上述方法进行学习记忆测试，按痴呆标准以假手术组大鼠逃避潜伏期的平均值作为参考值，计算VD大鼠逃避潜伏期的平均值与参考值之差占该鼠逃避潜伏期的比值，若该值大于20%为痴呆鼠。1.3 电镜标本的制备 大鼠断头处死后，参照大鼠脑图谱，迅速切取右侧海马区组织块，迅速放入4预冷的4%戊二醛中固定，常规脱水、Epon812环氧树脂包埋，LKB超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，应用日立H7500型透射电镜观察。1.4 免疫组化试剂及方法 SS兔抗大鼠多克隆抗体、神经元型NOS (nNOS)兔抗大鼠

15、多克隆抗体、免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)试剂盒(均购自武汉博士德生物工程有限公司)，采用SP免疫组化技术，实验步骤按试剂盒说明进行操作。将石蜡包埋组织连续4 m切片，常规二甲苯脱腊，梯度酒精水化，进行微波抗原修复，PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。在海马CA1区及颞叶皮层，分区选择3个相邻视野，在400倍光镜下作免疫反应阳性神经元计数，结果取3个视野的平均值。1.5 统计学处理 实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，所有数据采用运用SPSS11.5医学统计学软件处理。2 结 果2.1 行为学测试 应用水迷宫实验，对两组大鼠学习记忆成绩进行比较，

16、结果表明MDG组大鼠的逃避潜伏期较SOG组明显延长(P<0.05)，MDG组大鼠的跨平台次数较SOG组明显减少(P<0.05)，见表1，说明VD大鼠学习记忆能力降低。表1 水迷宫试验中小鼠的学习和记忆成绩与SOG组比较：1)P<0.05，下表同2.2 透射电镜观察 SOG组可见神经元核膜完整，细胞器结构正常，线粒体结构清晰，可见溶酶体、粗面内质网。MDG组可见神经细胞高度水肿，细胞核变性，核固缩或崩解;线粒体肿胀，嵴的双层膜结构不清、断裂、萎缩，重者线粒体高度空泡化，正常线粒体少见;粗面内质网严重脱颗粒。见图1。2.3 海马区及颞叶皮层区SS、nNOS阳性细胞表达情况 免疫组

17、化结果表明，与SOG组比较MDG组SS的表达明显下降(P<0.05)，nNOS的表达明显增加(P<0.05)，见表2、图2。表2 海马区及颞叶皮层区SS、nNOS阳性细胞表达情况     3 讨 论智能障碍是VD的主要症状，其中学习记忆能力减退尤为明显。本研究行为学结果显示，MDG组的逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数也明显减少，表明VD大鼠学习记忆能力降低，与文献报道一致1。本研究透射电镜观察MDG组可见神经细胞高度水肿，细胞核变性，核固缩或崩解;线粒体肿胀，嵴的双层膜结构不清、断裂、萎缩，重者线粒体高度空泡化，正常线粒体少见;粗面内质网严重

18、脱颗粒。结果显示，MDG组大鼠行为障碍的程度与海马神经元变性、水肿程度平行。SS为从下丘脑分离出来的能抑制生长激素分泌的14氨基肽，具有激素和神经递质的双重作用。作为一种神经递质广泛分布于中枢神经系统和外周组织，参与了学习和记忆的过程，其含量降低与痴呆存在明显相关性。早期研究发现痴呆者皮质、基底核、边缘系统SS含量明显降低。国外文献报道多梗塞性痴呆(MID)患者CSF中SS降低与痴呆程度呈正相关4，还有人认为SS神经元的损害可能是痴呆神经递质发生紊乱的最早启动环节5。本研究结果显示MDG组在海马区及颞叶皮层区SS阳性细胞表达明显减少，证实SS表达减少与VD大鼠的学习记忆功能减退有密切关系，提示

19、SS参与了VD的病理过程，与文献报道一致6。SS在VD发病机制中的作用尚不清楚，有学者认为SS调控学习和记忆的途经可能与直接兴奋SS能神经元引起钙离子内流增加有关;此外，也可能由于SS能神经元和胆碱能神经元相距很近，SS可促进乙酰胆碱释放从而影响学习和记忆功能。NO是一种血管活性物质，在中枢神经系统内具有保护和毒性双重作用，外源性或内源性的NO过量产生或释放时具有神经毒性，其与学习记忆的关系集中表现为NO在小脑、海马长时程突触增强(LTP)中的作用。脑内NOS至少有3型7：在神经元表达的nNOS，在神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞)表达的诱导型NOS (iNOS )和内皮细胞表达的内皮型NOS(eNOS)。在缺血性脑损伤中3种不同的NOS 催化产生的NO起着不同的作用，其中nNOS催化产生NO参与脑缺血后神经元损伤。nNOS是一种钙依赖性NOS，其活性受细胞内Ca浓度的影响，在正常生理情况下催化产生的NO作为中枢神经系统细胞间信使分子，可促进LTP的形成，在学习记忆机制中具有重要作用。脑缺血时谷氨酸释放增加，使NMDA受体依赖的Ca通道过度激活，大量Ca内流并与CaM结合，当神经元内Ca浓度达0.11 mol/L时，受到CaCaM直接调节的NOS被大量激活，导致合成过量的NO,产生神经毒性作用。Huang等8实验确定了nNO