诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用

1、诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用【摘要】 目的: 建立能稳定分泌抗诺如病毒（Norovirus）N蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法: 用E.coli表达的G组广州株NVgz01（DQ369797）NorovirusN蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、 免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对。结果: 通过细胞融合和克隆化,

2、 共筛选出4株分泌抗NorovirusN蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的G组广州株NorovirusN蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的G组Norovirus产生特异性反应。配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度。结论: 获得了诺如病毒G组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。 【关键词】 Norovirus NVgz01 核衣壳蛋白 单克隆抗体诺如病毒作为流行性肠胃炎的主要病因之一

3、, 无论在家还是发达国家, 从儿童到成年人都可以受到诺如病毒感染, 并可造成爆发流行, 成为影响人类健康的不可忽视的问题, 近年来逐渐引起了研究者的重视。美国CDC经过评估认为, 每年在美国发生的食源性疾病有2 300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起的1; 在欧洲, 数据显示19952000年间, 有超过85的食源性病毒肠胃炎爆发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起2。由于人类诺如病毒分为G和G两组3, 4, 根据北京5、 太原6和武汉7三地的血清学调查结果, 初步认为G组病毒为我国主要流行组。由于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定, 目前对诺如病毒的诊断方法主要是免疫电镜法（I

4、EM）、 放射免疫法（RIA）、 ELISA法、 RealTimePCR法等8, 其中, 夹心ELISA方法, 即使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法, 由于交叉反应性小, 特异性较强且敏感度较高, 成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达的G组广州株NorovirusN蛋白作为免疫原, 免疫BALB/c小鼠并制备mAb, 为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c

5、小鼠, 购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒 pET28a（）NoroNP由本实验室制备及保存, 诺如病毒N蛋白基因的克隆、 表达和鉴定方法见报道9。PEGMW3350购自Sigma公司, HAT、 HT 和RPMI1640购自Gibco公司, 新生牛血清购自杭州四季青公司, 羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。1.2 方法2 结果2.1 分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立 用pET28a（）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒G组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠, 取小鼠血清测效价, 在满意滴度下将

6、小鼠进行脾内加强免疫, 3 d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10 d后用纯化的NVNP 5 mg/L包被酶标板, 杂交瘤细胞上清作为一抗, 羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体, 并同时用pET28a（）载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照, 以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a（）载体成份反应的假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化, 共筛选出4株能稳定分泌抗诺如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株, 分别为N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。2.2 腹水效价的测定 收集腹水, 用间接ELISA方法测定, 结果N2C3和N7C2 2株抗体最强, 腹水稀释至10-

7、6P/N值为0.4; N4B1株抗体较弱, 腹水稀释至10-4P/N值为0.5; N8A9株抗体最弱, 腹水稀释至10-3P/N值为0.3（阴性对照P/N值为0.08）。2.3 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 用PIERCE公司试剂盒对mAbIg的类型和亚类进行特异性鉴定, 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和 N4B1）, 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和 N8A9）, 4株mAb轻链均为链。2.4 mAb特异性检测 4株mAb分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blot检测, 表达重组蛋白上由于带有表达载体上的T7和（His6）标签, 因而Mr比天然诺如病毒核衣壳蛋白（M

8、r为5610358103）多了3103左右。Western blot结果见图1, mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应, 并且可以同天然诺如病毒核衣壳蛋白进行特异性反应。其中N2C3和N7C2的反应性较强, N8A9和N4BI对粪便标本的反应性较弱。图1 mAb的Western blot分析（略）Fig 1 Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV stool sample with four mAbsA: N2C3; B: N8A9; C: N7C2; D: N4B1. 1: Native

9、norovirus stool sample; 2: Expressed recombinant protein of Norovirus NVgz01.1 2.5 mAb配对试验和初步应用表1 N2C3、 N7C2和N4B1 mAb在夹心ELISA中的结果（略）Tab 1 Sandwich ELISA results for N2C3, N7C2 and N4B13 讨论 诺如病毒最早发现于1972年, 由Kapikian等11借助免疫电镜技术（IEM）观察到一种病毒颗粒, 并根据发病地区将此病毒命名为 Norwalk virus(NV)。此后, 越来越多的诺瓦克样病毒在世界各地被发现, 这

10、些分离得到的病原都以其流行地区或发病特征等命名。1993年Jiang等12通过分析诺瓦克病毒的cDNA克隆的核酸序列发现其属于杯状病毒属（calicivirus）, 后根据病毒RNA聚合酶区或衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较, 将人类杯状病毒（HuCV）分为3个基因组（genogroup）:组（代表株NV）、 组（代表株SMA）和组（代表株Sapporo）。现将这3组病毒统称为诺如病毒（Norovirus）。诺如病毒在我国最早发现于1995年13, 后于我国多个城市和地区均有发现。根据报道, 当前G组病毒为主要流行的诺如病毒14。 诺如病毒是单股正链RNA病毒, 其基因组长度为77.5

11、 kb, 包括3个ORF, 其中ORF2编码一个Mr为5865103的病毒核衣壳蛋白15。由于诺如病毒在感染患者粪便中排毒量少, 排毒时间短, 且无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定16, 因此为了对诺如病毒进行进一步的研究, 制备mAb, 或研制疫苗等, 都只能依靠表达系统来完成。自20世纪80年代通过杆状病毒表达系统确定了ORF2为病毒核衣壳蛋白编码序列后, 对诺如病毒的免疫学研究工作主要都通过表达ORF2来进行。 诺如病毒广州株NVgz01（DQ369797）为本实验室测出的本地流行株, 经同源性分析属于诺如病毒G组17, 符合我国人杯状病毒的流行趋势。过往研究者在研究ORF2

12、时多采用杆状病毒载体系统来表达, 且表达的核衣壳蛋白可以自行组装成病毒样颗粒, 但杆状病毒表达系统相较于E.coli表达系统而言费时费力。E.coli表达系统操作简便, 重组蛋白产量高, 并且可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化。Tomoko等18的研究证实, 用E.coli表达系统也可以表达出用于免疫研究的病毒核衣壳蛋白, 并且证实重组蛋白具有良好的抗原性, 因而本实验也采用E.coli表达系统表达诺如病毒核衣壳蛋白。利用Ni2亲和层析柱对重组N蛋白进行纯化, 纯化后表达蛋白纯度占总蛋白的95以上, 用此纯化后的重组蛋白作为抗原免疫小鼠, 然后制备mAb。为了保证制备mAb的特异性,

13、我们使用表达轮状病毒VP6的pET28a（）VP6BL21的细胞裂解液作为阴性对照, 确保了所获得的杂交瘤细胞分泌的抗体均是针对诺如病毒重组N蛋白的。经过多次克隆化, 共获得了4株稳定分泌抗衣壳蛋白抗体的杂交瘤细胞株, 并对mAb Ig的类型和亚类进行特异性鉴定, 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和N4B1）, 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和N8A9）, 4株mAb轻链均为链。虽然本实验使用的二抗是羊抗鼠IgG, 但其能筛选出IgM的原因可能是此二抗识别的表位是位于IgG和IgM所共有的恒定区上, 因而在ELISA过程中此二抗也有可能识别出IgM。根据ELISA和Western b

14、lot检测结果分析, N2C3、 N7C2、 N4B1和N8A9均与表达衣壳蛋白有良好的反应性和特异性, 并且都与患者粪便标本中的天然诺如病毒具有反应性和特异性, 其中N2C3和N7C2 2株的反应性和特异性都较强。根据N2C3和N7C2的配对结果, 以重组表达蛋白作为样本进行检测时, 样本浓度稀释至0.042 mg/L时P/N值仍能达到1.1391.452, 证明N2C3和N7C2 2株抗体之间的配对检测具有较强的灵敏性和特异性。在此配对结果基础上, 对53份PCR检测为Norovirus G组阳性的腹泻患者粪便标本进行检测, 共检出35份阳性结果, 阳性率为66。出现PCR结果和ELISA

15、结果不完全相符的原因可能是由于PCR方法的假阳性率比较高, 或是配对的两株单抗在病毒组内表现株型特异性, 这两种可能性都有待进一步研究证实。【文献】 1 Mead PS, Slutsker L, Dietz V, et al. Foodrelated illness and death in the United StatesJ. Emerg Infect Dis, 1999, 5(6): 607-625.2 Lopman BA, Reacher MH, van Duijnhoven Y, et al. Viral gastroenteritis outbreaks in Europe, 19

16、95-2000J. Emerg Infect Dis, 2003, 9(1): 90-96.3 Jiang X, Maston DO, Cubitt WD, et al. Genetic and antigenetic diversity of human caliciviruses (HuCVs)useing RTPCR and ELISAJ. Viral Gastroenteritis Arch Viral, 1996, 134(12): 251-262. 4 Berke T, Golding B, Jiang X, et al. A phylogenetic analysis of ca

17、licivirusesJ. Med Viral, 1997, 52(4): 419-424.5 靖 宇, 钱 渊, 王洛平. 北京地区人群诺瓦克样病毒血清抗体水调查J. 病毒学报, 1998, 14(4): 322-328.6 靖 宇, 钱 渊, 吴立平, 等. 太原市部分人群诺瓦克样病毒血清抗体水平的调查J. 中国儿科杂志, 1999, 37(9): 559-561. 7 刘满清, 谭 慧, 王 斌, 等. 90例非轮状病毒腹泻患儿粪便中诺瓦克样病毒的检测J. 疾病检测, 2005, 20(7): 362-363.8 段燕文, 黄 英. 诺瓦克样病毒胃肠炎的实验室和流行病学诊断方法J. 中国卫生检验杂志, 1995, 5(5): 313-316.9 李 潇, 周 荣, 胡龙波, 等. 诺瓦克病毒广州株N蛋白基因的克隆、 表达及抗原性鉴定J. 南方医科大学学报, 2007, 27(9):