肺炎球菌1型荚膜多糖多克隆抗体制备与夹心ELISA法建立及其在多糖浓度测定中的应用.docx

1、论著*肺炎球菌1型荚膜多糖多克隆抗体制备与夹心ELISA法建立及其在多糖浓度测定中的应用刘威，廖红梅，谢谦，黄放，邹莎莎，马诚，江山，崔长法(成都生物制品研究所有限责任公词细函性疫苗研究室，四川成都610023)摘要：目的利用肺炎球菌1型全菌体制备多克隆抗体，并旦利用该抗体建立肺炎1型英膜多糖夹心解联免疫吸附分析法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),用于检测发酵和纯化过程中的多糖浓度。方法用灭活的1型肺炎链球菌免疫家兔6周，获得高滴度的抗多糖血清，经过亲和层析纯化，获得高纯度的兔抗肺炎1型多械抗体IgG。以纯化IgC作为包被抗体，加入多牺样品,再以生

2、物素化的抗体作为检测抗体，建立夹心ELISA法检测肺炎1型多糖浓度。确定标准曲线的最佳线性范围，并对该方法进行特异性、准确性和精密度验证。结果兔免疫血清经过双向免疫扩散检测抗体滴度可达1：32；该方法的线性检测范围为1.5650n”mL；最低检测限为3.13n"mL。在标准品中混入其他型别多糖或培养基，回收率分别为102%和108%;该方法批内精密度和批间精密度分别为6.08%和7.01%。结论建立的夹心ELTSA方法，其特异性、准确性和精密度均良好，可以特异地检测肺炎球菌1型多糖浓度。关键词:肺炎球菌1型多糖;免疫学检测法;夹心EUSA；多糖浓度中图分类号：R378.P4文献标志码

3、：A文章编号：1005-5673(2013)05-0001-05Preparationofpolyclonalantibodiesagainstpneumococcalserotype1capsularpolysaccharideanddevelopmentasandwichELISAindeterminationofconcentrationfbrtype1capsularpolysaccharideUUWei,LIAOHong-mei,XIEQian,HUANGFang,ZOUSha-sha,MACheng,JIANGShan,CUIChang-fa(DepartmentofBacteri

4、alVaccineResearchandDevelopment,ChengduInstituteofBiologicalProducts,Co.,Lid,Chengdu610023,China)Abstract:ObjectiveTopreparepolyclonalantibodiesagainstcapsularpolysaccharideofpneumococcalserotype1,andusetheantibodiestodevelopasandwichELISAindeterminationofconcenlralionforpneumococcalcapsularpolysacc

5、harideofserotypeIintheprocessoffermentationandpurification.MethodsHightiterserumofanti-capsularpolysaccharideserotype1wasobtainedafterimmunizingrabbitsbyusingofinactivatedstreptococcuspneumoniaecellsofserotype1fbr6weeks.IgGwaspurifiedthroughaffinitychromatographyandusedasacoatingantibody.Polysacchar

6、idesamples,alonewithinhousepolysaccharidestandard,werethenaddedfollowedbyusingbiotinylatedantibodyasasignalantibody.Theoptimalinearrangeofthestandardcurve,specificity,accuracyandprecisionofthedevelopedmethodwerevalidatedaccordingly.ResultsTheantibodytiterofrabbitimmuneserumreachedto1：32,thestandardP

7、SIlineardetectionrangewas1.56ng/mLto50ng/mL,detectionlimitwas3.13ng/mL.Standardpolysaccharidewasmixedwithpolysaccharidesfromdifferentsenrtypesorculturemediabeforeasssay,therecoveryratiowas102%and108%respectively.Intra-as-sayprecisionandinterprecisionofthemethodwere6.08%and7.01%.ConclusionHightiterra

8、bbitanti-serumagainsttype1capsularpolysaccharideofstreptococcalpneumoniaewasprepared.ThedevelopedsandwichELISAmethodshowedhighspecificity,goodaccuracyandprecision.Thismethodcanbeusedinspecificdetectionofconcentrationforpneumococcalpolysaccharideserotype1.Keywords:Pneumococcalpolysaccharideserotype1;

9、Immunoassay;Sandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay(S-EL1SA);Polysaccharideconcentration收稿日期：20I3-06-25;修回日期：2013-07-14作者简介:刘威(1978-)，男，硕上,主要从事细菌性疫苗的研发工作。肺炎链球菌是引起肺炎、脑膜炎、中耳炎的主要病原体。美国有观察资料显示，估计每年有40-50万人罹患肺炎球菌性肺炎，病死率为5%10%o尽管使用有效的抗生素治疗，肺炎球菌感染仍可引起很高的发病率和病死率。接种肺炎荚膜多糖疫苗能够有效降低肺炎链球菌感染的发病率和病死率。制备肺炎荚膜多糖疫苗过程，

10、尤其是发酵和纯化过程中，进行多糖浓度监测，对优化发酵和纯化工艺、提高多糖产率非常必要。通常，检测肺炎荚膜多糖的方法为依赖硫酸降解的化学显色法，但是该类方法主要用于纯化后的多糖产品，不适合于杂质较多、浓度不高的多糖中间样品。为了提高检测的特异性和灵敏度,前人开发出免疫学方法,如速率散射比浊法和火箭免疫电泳法，但这些方法存在特殊设备要求、重复性不佳或血清需求量过大等限制因素。本研究通过全菌体免疫家兔，对血清进行纯化和生物素标记，获得高纯度抗肺炎球菌1型荚膜多糖（Pneumococcalcaspularpolysaccharideserotype1,PnPSl）多克隆抗体,建立夹心酶联免疫吸附法（E

11、nzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA），经过方法学验证后，对发酵的肺炎球萌1型多糖浓度进行检测，证明该方法的实用性。1材料与方法1.1菌种肺炎链球菌1型菌种由成都生物制品研究所有限责任公司（以下简称成都公司）提供，利用血清学方法鉴别血清型别是否正确。1.2试验动物SPF级新西兰大耳白兔，雌性，体重2.5kg,由成都公司动物室提供。1.3主要试剂PnPsl内部标准品由成都公司提供，批号CE20111031,见表1;A蛋白4FF亲和层析填料购自AppliedBiosystems公司；生物素化标记试剂盒和HRP标记亲和素购自Therm。公司；TMB购官KPL公司；

12、氟氏完全佐剂购自Sigma公司；标准肺炎球菌分型诊断血清购自丹麦血清研究所，批号G113b。表1肺炎球菌1型多糖标准品的质控结果Tab.IQualitycontrolresultforstandardPSIinhouse批号蛋白（%）核酸（%）相对分子质量（kD）糖醛酸（%）氧乙酰基（%）总磷（）总氮（）CE201110310.720.810.0352.005.200.273.201.4菌液制备肺炎1型链球菌接种于液体肉汤培养基（由成都公司提供），以10%C02于36丁经二级发酵共培养46h,用丹麦血清做凝集试验确定细萌血清型别为肺炎球菌1型;取少量菌液染色镜检，确定细菌生长状态良好，荚膜完整

13、；用麦氏比浊法确定细菌浓度。利用100T水浴灭活细菌30min,2000g离心5min,生理盐水洗涤菌体后，立即免疫动物。1.5动物免疫及血清抗体滴度检测初次免疫菌浓度为2x108个/mL,混合等体积福氏完全佐剂，多点注射于家兔皮下。此后，每周由耳缘静脉注射灭活全菌体1次，每次2X109个萌,共免疫5次。用双向免疫扩散确定抗体滴度至1：32o立即颈动脉采血，分离血清，保存于-20ro1.6多克隆抗体的纯化与标记PBS平衡兔血清至pH7.0,用A蛋白亲和柱吸附抗肺炎球菌1型多糖抗体，用pH3.。柠檬酸洗脱抗体，经12%还原SDS-PAGE和高效液相色谱（HPLC）分析鉴定纯度。纯化的抗体按照生物

14、素化试剂盒说明，进行生物素标记。1.7夹心ELISA方法的优化将肺炎球菌1型多糖抗体和标记抗体系列稀释，采用方阵滴定法确定二者的最佳工作浓度。建立步骤如下:在96孔酶标板中用pH9.6碳酸缓冲液包被1如分别为0.05白g/mL、0.15瞄/mL、0.45jig/mLJOOpX/孔,28T过夜孵育。次日洗板,加入含3%BSA的封闭液,200jit/孔，室温封闭1h；洗板3次，分别加入30ng/mL标准肺炎球菌1型多糖作为阳性对照或PBS作为阴性对照，室温孵育1h；洗板，加入1：3000至1:100000系列稀释生物素标记抗体JOOjiiy孔，孵育1h；加入HRP标记亲和素，反应1h；洗板后,TM

15、B显色,0.5mol/LH2SO4终止显色反应，酶标仪读取4切值。根据信/噪比最大原则，判断最适合的包被浓度和检测抗体浓度。注：PS：PnPSI；孔1：丹麦1型旬清”1/4；孔2、孔3、孔4、孔6：口制免血清，分别稀襟1/4.1/8.1/16,1/32；孔5：阴性对照图1双向免疫扩散测定肺炎球菌I型兔免疫血清抗体效价Fig.IDeterminationoftherabbitantilxxlylitersagainstpneumoniatypeIbydoubleimmunodifTusion140000100()005000()-44HMNI35(XM)25(MM)注：l8为系列稀择的纯化后肝样

16、品；M蛋白分子ht标准(260000.1400(X).100000,70000,50000,40000.35000.25000)图2还原SDS-PAGE检测IgG分子量及纯度Fig.2ReducedSDS-PAGEprofileofpurifiedrabbitanli-PnPSIsrnim注：PS：PnPSI；孔l：丹麦I羽旬清稀释1/4；孔2,孔3、孔4、孔6：自制兔血清.分别稀释1/4J/8J/16J/32；孔5：阴性对照图3纯化的兔抗肺炎球菌1型多糖IgG抗体的HPLC图谱Fig.3Th<*IIPIXIpnifilrMrabbitIgGantibodyagainstpnetim&l

17、t;K-(K-(-alpolysaccharidesertrtypeI1.8标准曲线的确立根据上述优化条件，将肺炎球菌I型多糖(PnPsI)标准品稀释至1.56100.00ng/mL,选择相关系数大于0.98,4询在0.10-2.00标准多糖稀释区间为最佳线性范围。1.9方法验证1.9.1特异性将PnPsl标准械溶于混有12种其他肺炎球菌血清型多糖(3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、I8C、19F、19A、23F,每塑终质量浓度50.00ng/ml.)的溶液中,用建立的夹心ELISA法检测其中I型多糖浓度，il算回收率。将标准多糖按照6.25ng/mLJ2.50ng/mL、25.00n

18、g/mL溶解于肉汤培养基中，计算其回收率。1.9.2准确性和精密度用该方法检测商(50.00ng/mL)、中(12.50ng/mL)、低(3.13ng/mL)3个浓度的PnPsl标准品，每个浓度币:复测定5次,连续检测3d,计算标准多糖回收率和批内及批间变异系数。1.10方法应用肺炎球菌I型萌种接种于20mL肺炎球苗培养基,10%CO?培养箱中36Y振荡培养4ho每30min取样1次，测定.4颂吸光度，并旦利用建立的夹心ELISA方法测定多糖浓度。2结果2.1兔免疫血清的抗体效价与IgG纯度经过6周连续免疫，采集全血，分离血清.通过双向免疫扩散法测定血清效价，丹麦血清所标准血清效价为1：4,&

19、gt;成都公司制备的兔免疫血清的抗体效价为1：32；两者与内部标准PnPsl形成一致的沉淀线，见图I。利用蛋仃A亲和层析纯化血清，获得高纯度的抗肺炎多糖1型IgG,经12%还原SDS-PAGE进行分析.可见相对分子质贵分别约为55000的重链和23000的轻链，见图2O利用HPLC检测纯度大于90%,见图3。2.2最佳工作条件及标准曲线的建立最佳工作条件及标准曲线的建立.见参考文献8,经方阵滴定法稀释包被抗体与生物素化检测抗体，结果显示当包被抗体为0.15jig/mL,生物索化抗体在1:30(XM)(约70.00ng/mL)时信号与背景:依比例最大，见表2c在此条件下，肺炎球留I型多慵在1.5

20、65().(X)ng/mL,线性相关系数尸为0.98以上，见图4根据背景吸光度3倍换算并通过验证,该方法最低检测限为3.13ng/mLo表2方阵滴定法确定ELISA最适反应条件Tab.2DeterminationofoptimalconditionforELISAwithacheckboardmethd生物素化抗体稀释倍数包被抗体质量浓度(瞄/ml.)抗原(30n"mL)0.050.150.451：30002.3422.3252.362PS11:10(XX)1.8031.9242.013PS11：300001.2821.6431.732PS11：1000000.5820.6320.9

21、32PS11：30000.2550.2850.362PBS1：100000.1340.1420.145PBS1：300000.0640.0680.129PBS1：1000000.0610.0910.125PBS图4夹心ELISA法测定PSI浓度标准曲线Fig.4ThestandardcurveofthesandwichELISAtodeterminePSIconcentration2.3方法验证2.3.1特异性验证在50.00ng/mL肺炎球菌1型标准多糖溶液中混入3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、I9A、I9F、23F共12种其他血清型肺炎球菌多糖(每型终质最浓度50.00n

22、g/mL),测定肺炎球菌1型标准多糖质量浓度为51.26ng/mL,回收率为102%。将50.00ng/mL标准多糖溶解于肺炎肉汤培养基中，计算其回收率为108%,见表3。2.3.2准确性验证和精密度验证利用该夹心EUSA法检测高(50.00ng/mL)、中(12.50ng/mL)、低(3.13ng/mL)3个浓度的PnPsl标准品，每个浓度重复测定5次，其回收率为96%108%,见表4,批内变异系数小于6.08%；连续3d检测上述标准品，批间变异系数小于7.01%,见表5。表3肉汤培养基中肺炎1型多糖浓度Tab.3TherecoveryratioofPSIconcentrationmixed

23、withbrothmedia加入多耕质量浓度(ng/mL)检测结果(ng/mL)均值(ng/mL)回收率(%)49.2047.2050.0056.5050.4010848.知50.90表4标准多糖检测回收率Tab.4TherecoveryratioforstandardPSIPS1标准品质垦均值回收率浓度(ng/mL)(ng/mL)(%)50.0050.43±1.5210112.5012.06±0.67963.133.37±0.06108表5夹心ELISA法测定标准PnPSl精密度验证结果Tab.5ValidationresultforprecisionofPSI

24、bysandwichELISAPSI标准品批内精密度(n=5)批间精密度质瓦:浓度均值CV%均值(ng/mL)CV%(ng/mL)(ng/mL)50.0050.381.8850.552.8612.5011.066.0811.427.013.133.371.773.335.622.4方法应用将肺炎1型菌种接种于20mL肺炎球菌培养基中，10%C0236T振荡培养4h,期间每30min取样1次，测定4颂吸光度，以此判断细菌生长浓度变化趋势。同时利用建立的该夹心ELISA方法测定PS1浓度，结果显示，随肺炎链球菌浓度的增高，多糖质旱浓度增高至2.90瞄/mL,见图5。3讨论肺炎链球菌英膜多糖浓度检测

25、通常使用硫酸慈酮法、硫酸咔喋法等化学方法,该类方法的检测灵敏度为微克级，并11该类方法对样品纯度要求较高。为了能够灵敏且特异的检测出发酵过程中多糖浓度图5肺炎1型链球菌生长过程中多糖质量浓度变化趋势Fig.5Thechangetrendoftype1polysaccharidemassconcentrationintheprocessofthegrowthofserotype1streptococcuspneumonia的变化趋势.为生产工艺的优化和稳定提供数据，研究开发出夹心ELISA法,与其他夹心ELISA的不同之处在仅需要制备一种动物来源的抗体,从而免去了制备两种以上动物来源抗体的繁琐。

26、成都公司细菌性疫苗研究室前期利用全性体免疫家免，所得免疫血清经双向免疫扩散检测抗体滴度很低改用新鲜培养的细慎，用沸水火活后，能最大限度保证细I宥荚膜的完整性*。用全菌体混合福氏完全佐剂，进行家兔初次免疫，再用全侑体进行静脉加强免疫.能明显提高抗体滴度,双向免疫扩散检测达1:320研究将扶得的高滴度兔血清通过亲和层析进行纯化，拱得了高浓度的抗肺炎多糖IgG抗体。包被该抗体.能有效降低EI.1SA检测中的非特异性吸附。生物素勺亲和素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性研究利用生物素对多糖抗体进行标记,当这种抗体特异识别多糖,并形成抗原抗体发合物后，生物索再与标记辣根过氧化物的的亲和索特异结

27、合。这个信号是多级放大的过程，非常适合检测培养基中低浓度的多糖含bt,研究显示最低检测限为3.13ng/mL,完全满足生产过程中对低浓度样品检测的需要：方法验i正显示，即使混入结构相似的其他型别肺炎多械.或倒讷汤培养基中多种成分的干扰，该方法也能特异准确定bt肺炎球保ii型多精。另外对该方法进行批内和批间精密度验证，结果显示所有变异系数均小于15%,证明该方法稳定适用，可以用F对*糖生产过程中浓度的质hl:控制将该方法用于实际肺炎球萌发醉过程检测，结果显示,随者发酵时间延K,细前浓度逐步增A，其择放的荚膜多糖也逐渐增多；已经有文献报道.随着到达生长平台期,肺炎球菌释放自溶酶的活性增强.有更多的

28、英膜多糖被切进入培养基,0：o研究发现.发酵4h后，细萌浓度达到最高，然后逐渐下降，但.是此时多糖浓度仍继续增高，证明r上述观点。参考文献HamptonLM,FarlejMMtSchuffiwrVi,Hal.Preventionofanli-Slrqfliatccusimrumimiacwilhconjugatevac-cin<*«J.JounalofInfeclDis.2012.205(3)：40I-4l1.1 MaX.YaoKII,Xie(J.Hal.(«haractenz4ili(>nMrnlhrrHnyrin-rr?*iMantSnyMorocruspf

29、ieunioniaecausinginvasivedi>ra-wminChinrM*childrenJ:.ChinMrdJ(Engl),2013.126(8):1522-1527.13AnsaldiF.IXFlorrnliis1).(umqiaP.Hal.SrnRyiwreplacenwntinStrqacocaASpnmmoniarafter(*<>njiigah*vacciiwintHMluc*tion：im(KU*t.doubtsamiprrspreliu*fornewvac<'in«*sJ.Mirn>lnolt2010.21(3)：56-(4.4L-yvaAtQuintanaAvSinchrzM,rtal.Rapi<lamix-iiMlivran-thnHir-sulfiiric'acidassayininicnqilatcformatto(|uantifycarlxJiy-<lralrinbi(>|)lianna<'riiti