胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响.docx

1、胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响史爱华，姜北宇,沈佳，景小冬,章振华，李林，张建伟*(北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京100097)摘要目的探讨不同胰果白醇浓度的低致病力禽流感病毒在MDCK钿胞上增瑾后的HA滴度。方法通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK触胞单层，加入含有不同胰妥白的浓度的DMEM堆持液，每隔24h观察细胞病变，并测定上清液中的HA滴度。姑果当维持液中胰蛋白够含量为10-20她ml时，培养液上清液中的HA滴度最高，达到7log2(l：128)o当病毒的接种浓度为KT，和10"时,MDCK幼胞在96h几乎全部病变，峰值出现在接种后的7

2、296h°结论当维持液中胰姿白酶含量为1020pig/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK初胞上增殖，关键词H9N2亚型禽流感病毒;MDCK细胞；胰蛋白醇浓度中图分类号S851.3文献标识码A文章编号0517-6611(2011)35-21813-03EffectsofTrypsinonProliferationofAvianInfluenzaVirusH9N2SubtypeinMDCKCellSHIAi-huaetal(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BeijingAcademyofAgricultureandF

3、orestrySciences,Beijing100097)AbstractObjective'Hiestudyaimstodeterminetheoptimalconcentrationoftrypsinforproliferationofavianinfluenzavirus(AIV)H9N2subtypeinMadin-Darbycaninekidney(MDCK)cell.MethodThreeAIVH9subtypeisolateswereinoculatedonMDCKcellsrespectively.*n)en,DMEMcontainingdifferentconcen

4、trationsoftrypsinasmaintenancemediawereaddedtoMDCKmonolayercells.Hiecytopathiceffect(CPE)wasobservedonceevery24h,andtheHAtiterofthesupernatantwasmeasuredbyHAassay.ResultWhenthetrypsinconcentrationwas10-20jig/mlinDMEM,theHAtiterofvirusculturereached7log2(1：128).Almostallcellswerecytopathicafter96hpos

5、tinoculationwith11000or1：10000dilutionofAIVculture,andthevirustiterreachedapeakafter72-96h.ConclusionHieoptimalconcentrationoftrypsinis10-20吗/mlforproliferationofAIV】I9、2subtypeinMDCKcells.KeywordsAvianinfluenzavirus;H9N2subtype；MDCKcell;Trypsi'禽流感(Avianinfluenza,Al)是由A型流感病毒引起的一种家禽和野禽的感染疾病综合征。其中

6、，低致病力H9亚型的禽流感病毒(LPAIV)虽然致病力较低，但仍可以导致患病鸡群鸡只死亡和产蛋下降。生产实践表明，疫苗免疫是防止禽流感暴发的主要措施之一。近年来,H9N2亚型禽流感在免疫鸡群中时有发生，严重制约着我国养禽业的发展。叶柱德等对H9N2禽流感疫苗的研究进行了综述。鸡胚是禽流感病毒最为常用的一种培养基，常用于分离禽流感病毒和制备疫苗。但是，用鸡胚尿囊液分离或传代禽流感病毒易引起抗原性变异,大规模生产时还存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污染的问题。以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好地维持病毒抗原稳定等优点。另外，许多学者对MDCK细胞用于制作人流感疫苗

7、作了大量研究O由于禽流感病毒感染细胞时需要先将HA基因裂解为HA1和HA2才能感染人或禽的细胞,这种裂解可以通过胰酶处理增加其感染性笔者通过研究维持液中不同胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响，以确定最佳的培养条件.为利用MDCK细胞制备禽流感病毒抗原探讨最优的培养条件,并为利用生物反应器大规模制备禽流感抗原奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1 毒株。禽流感病毒H9N2型地方分离毒株：A/Chicken/Hebei/WD/98(H9N2)株(简称WD98株)，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室1998年从河北基金项目北京市农妹科学院资助项目(2010A0

8、07)。作者简介史爱*(1978-)，女，满族，北京延庆人，助理研究员，从事畜禽疫病防控研完。*通讯作者,副研究员，从事生物制品研究,E-mail:jweizhang。收稿日期201148-31concentration省望都县分离；A/Chicken/Henan/QV04(H9N2)株(简称HN04株)，由河南农业大学王泽霖老师惠赠;A/Chicken/Hc-bei/ZD/04(H9N2)株(简称ZD04株)，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室2004年从河北省正定县分离。1.1.2细胞°MDCK细胞购自中国兽医药品监察所，在北京市农林科学院畜牧咨医研究所免疫预防研究室

9、传代培养至所需代次。1.1.3细胞培养液。生长液为含10%胎牛血清和100IU/ml青毒素-链霉素的DMEM；维持液为含0100ji"ml胰蛋白酶的DMEMO1.1.4鸡红细胞悬液°浓度1%的鸡红细胞悬液由北京市农林科学院畜牧兽医研究所免疫预防研究室采集成年公鸡血液制备而成。1.1.5主要试剂。DMEM培养基由HyClone公司生产;胰前由DIFC0公司生产;胎牛血清为GIBCO公司生产;细胞培养瓶、培养板均由COSTAR公司生产。1.2方法MDCK细胞的复苏及传代。自液氮中取出冻存的MDCK细胞,38T温水速溶,3000r/min离心3min,弃上清，用含10%犊牛血清的

10、DMEM悬浮细胞至7ml,加入到T25培养瓶中，置37T、5%C02温箱培养。经过4872h培养后MDCK细胞长成单层，弃上清,用1mlEDTA-胰蛋白酶清洗细胞表面，然后加入0.8ml胰蛋白酶37幻消化25min,吹打分散细胞，调整细胞浓度为1X105个/ml,加入到T25或者T75培养瓶，扩繁一定数量后，采用同样方法制备12孔板细胞培养板若干，置于37T、5%C02温箱培养用于试验。1.2.2不同浓度胰蛋白酶维持液的配制。取胰蛋白酶浓度为0.25%胰蛋白醵4ml加入到6mlDMEf营养液中，即可得到浓度为0.1%的腹蛋白酶液(即100()|ig/m)，分别以此母液按照0.5%、1%、1.5

11、%、2%、2.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%.5.0%J0.0%的浓度加入到DMEM营养液中即可得到相应胰蛋白熊浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100pig/ml的维持液。1.2.3病毒稀释。根据分组，每组取无菌试管5支进行编号，每支分别加入相应胰蛋白熊浓度的DMEM维持液4.5ml,第1支试管加入0.5ml病毒原液并振荡混匀，白第I支试管吸取0.5ml稀释的病毒液加入到第2支试管中混匀.再吸取0.5nil稀释的病卷液加入到第3支试管，以此类推至第5支试管，各试管中病毒液稀释倍数分别为10'JO2,10104J05o1.2.4维持液中不同胰蛋白

12、酶浓度对不同毒株的禽流感H9亚型病毒在MDCK细胞上的增殖影响,(1) 维持液不同胰酶含量对HNO4株H9亚型AIV病毒滴度影响。取长成单层的MDCK细胞12孔培养板12块，轻轻晃动培养板.用吸管吸去每孔生长液，然后再用DMEM清洗1次,标记培养板为112,第I11板分别每孔接种万倍稀释的HN04株H9亚型AIV病毒0.2ml,不吸附，接种后第111板每孔加入1.8ml含有0、5、10、15、20、25、30、35、40、45.50jig/ml胰蛋白酶的DMEM维持液。第12板不接种病毒，前3列每孔加入2mlDMEM,为不接病毒不加胰蛋白酶的空白对照;后3列每孔加入含有10胰蛋白酶的DMEM维

13、持液为不接病毒加胰蛋白酶的空白对照°加完培养液后所有培养板均放在37X.5%CO,细胞培养箱中培养，每隔24h取样并测定上清液中禽流感病毒的HA滴度，至细胞完全脱落。(2) 病毒接种浓度和维持液不同胰蜂含量对ZTXWJINCM、WD08株H9亚型AIV病窿滴度的影响一，试验方法基本同(1),胰蛋白酶浓度分别为0、5、10、15、20、30、50、100病毒稀祥度分别为10倍稀释病毒和105倍稀释病毒接种组,每个稀释度的病毒和每个胰蛋白酶浓度接种3个孔。1.2.5HA滴度的测定。分别取病毒接种细胞后24、48、72、96和120h的细胞培养上清液,采用常规方法进行红细胞凝集试验.即在9

14、6孔V型板中加入50pl生理盐水，与50W待检细胞培养上清液混匀后进行倍比稀释，并设阳性、阴性和空白对照孔。每孔中加入50pd1%鸡红细胞悬液，使用振荡器振荡20s左右，室温下静置15-20min,观察记录结果。测定结果取以log2为底的倍数。2结果与分析HN04株接种MDCK细胞后加入不同胰蛋白酶浓度维持液对AFV病毒HA滴度的影响由表1可以看出，当维持液中胰蛋白醯浓度为545pig/ml时，均可以产生较高的HA滴度,其中胰蛋白酶浓度为525岫ml时，病毒接种后7296h滴度最高，为5.771。命，其中最高的HA滴度为胰蛋白酶浓度为20"ml.接种后96hHA滴度为71码八不含胰酶

15、组直到96h才产生了较低的HA滴度。此外.不接种病毒.只加胰蛋白酶组也无HA滴度。2.2病毒接种浓度和维持液不同胰酶含量对ZD04、HN04、WD08株H9亚型AIV病毒滴度影响ZDO4株A1V病毒104倍和105倍稀释后接种MDCK细胞.加入不同胰蛋白酶浓度(0100岫ml)维持液对A1V病毒HA滴度的影响。由表2可知，不含胰蛋白酶的维持液组中，10倍稀释病毒组在120h产生了较低的HA滴度，而105倍稀释组无HA滴度，在含有胰蛋白酶的各组中104倍稀释病毒组一般较105倍病毒稀释组产生HA滴度的时间早24h,但在96h时任何接种浓度均能产生相似的HA滴度、较高的HA滴度产生在胰蛋白酶浓度为

16、53Ojxg/mL当胰蛋白酶浓度高于30jig/ml时，会造成细胞脱落，影响病卷滴度C表1HN04株接种MDCK后不同胰蛋白酵浓度培养液上清液的HA滴度(logjTable1HAtiterofavianinfluenzavirusHN04strainafterinocuia-tiononMDCKcellsandmaintenanceinDMEMcontainingdilTerentconcentrationsoftrypsin培养时间Incubation0510152025303540455024000000000004801.83.14.83.33.32.43.4353.8097204.85

17、.76.36.26.65.36.5596.438960.65.86.36.676.86.36.8596.3421200.85.76.26.16.36.25.76.1545.8461680.95.6666.46.25.66515.636维持液胰蛋白酶浓度Trypsinconcentrationinmaintenancefluidml等:度中数据为12孔的平均滴度。Note：ThedataistheaverageHAtiterofviruscullurwlin12wells.表2ZD04株不同浓度接种MDCK后不同胰蛋白醯浓度培养液上清0-51015203050100240/00/00/00/00

18、/00/00/0()/0480/00/01/02/02/01/01.7/0.70.5/1.5720/03/14/2.73.7/34/1.33.7/3.53/1.32.5/1.5960.3/03.3/3.34.3/4.74/45/4.34.3/53/3.72.5/31203/04/44/4.74/44.6/4.74/53.3/42.5/3.5液的HA滴度(log：)Table2HAtiterofavianinfluenzavirusZIMMstrainafterinoculationonMDCKcellsandmaintenanceinDMEMcontainingdiffer-entconcen

19、trationsoftrypsin维持液膜蛋白隅浓度培养时间TrypsinconcenlrationinIncubationmaintenancefluid)1ml注:表中数据表示1：10(MX)和1:100000稀释后病毒接种1DCK细后培养液上清液的HA滴度。Note：TheHAtiterofviruscultureafterinoculationwith1:10000dilutionofAIVisshownineachframe.followedbythatafterinoculationwith1：100000dilutionofAIV.WD98株AIV病毒"倍和105倍稀释

20、后接种MDCK细胞，加入不同胰蛋白酶浓度(0-100必/ml)维持液对AIV病毒HA滴度的影响。由表3可知，同胰蛋白酶浓度时.I04倍稀释接种较105倍稀释接种产生的HA滴度早24h.较高的HA滴度产生在胰蛋白酶浓度为530jig/ml试验组中。2.2.1 HD04株AIV病毒"倍和10倍稀释后接种MDCK细胞.加入不同胰蛋白酶浓度维持液对AIV病毒HA滴度的影响。由表4可以看出，HN04株病毒接种的稀释度为1：10000时.接种后的HA滴度产生较使用病毒稀释度为1：10000()时接种早24h,较高的病毒滴度产生在53()jig/ml时，培养120h后HA滴度无明显差异。衰3WD9

21、8株不同浓度接种MDCK后不同胰皆白酸浓度培养液上清液的HA滴度(logj培养时间Incubationtimeh绯持液袂蛋白酶浓度Trypsinconcciitrationin,maintenancefluid|j/ml051015203050100240/00/00/00/00/00/0o/o0/0480/01.7/1.34.3/04.3/05.7/4.75/0.64.3/02.3/2.572o/o4.7/1.75.7/1.75/25/65.7/35/44/4962/05/55.3/4.75/4.56/66/45/54/3.51203/05/55.3/5.35/55.7/65.7/55/54

22、/4Table3HAtiterofavianinfluenzavirusWD98strainafterinoculationonMDCKcellsandmaintenanceinDMEMcontainingdifferentconcentraUonsoftrypsin注:表中数据表示：1：10000和1：100000稀释后的病毒接种MDCK细胞后培养液匕清液的HA滴液。Note：TheHAtiterofviruscultureafterinoculationwithI：10000dilutionofAIVisshownineachframe,followedbythatafterinocula

23、tionwithI：100000dilutionofAIV.衰4HD04株不同浓度接种MDCK后不同胰龈白横浓度培养液上清液的HA滴度log,)Table4HAtiterofavianinfluenzavirusHD04strainafterinocula*tiononMDCKcellsandmaintenanceinDMEMcontainingdifferentconcentrationsoftrypsin维持液胰蛋白酸浓度051015203050100240/00/00/00/0o/o0/00/00/04S0/05/03.7/04.3/06/3.35/1.75/23.7/0720/05.7

24、/45/5.75/5.35.7/6.36/35/24.7/0.5961/06/55.7/5.75.3/5.76/66/45/44/21204/06/55.7/5.75.7/5.76/65.3/55/4.74/3.5培养时间TrypdinconcentrationinIncubationmaintenancefluidmllimeh注:表中数据表示：1：10000和1：100000稀辙后的病毒接种MDCK细胞后培养液上清液的HA滴度。Note：TheHAtiterofviruscultureafterinoculationwithI：10000dilutionofAIVisshownineach

25、frame.followedbythatafterinoculationwithl：100000dilutionofAIV.3讨论'3.1胰蛋白前浓度对HA滴度的影响3株I.PAIV病毒接种经过用DMEM培养液洗涤的细胞单.层后，当维持液中胰蛋白酶含量为0瞄/此时，培养液上清中直到96h才出现较低的HA滴度；当维持液中胰蛋白酶浓度为550必ml时.对同一病毒株所产生的HA滴度没有显著的差异。但是，随着胰蛋白酶浓度的增高，尤其是胰蛋白输浓度达40;时，细胞单层生长受到影响，部分细胞脱落，影响HA滴度。、因此,建议维持液中胰蛋白酶浓度维持在】020Wml较为适宜。3.2培养时间对HA滴度的

26、影响研究表明,所有试验组的MDCK细胞单层接种LPAIV病毒后24h内培养液上清液中未检测到HA滴度。刘丽玲等研究表明HPAIV红细胞凝集活性较LPAIV出现的要早.H5N1亚型的A/Goosc/Guangdong/1/96在感染MDCK后12h开始有HA滴度.其他亚型H9N2JI5N2和H7M毒株均在感染后24h开始出现HA滴度。该研究与刘爱玲的研究结果相吻合。这是因为HPAIV感染细胞后可自动裂解，而LPAIV的进一步裂解需要胰酶的辅助。随着培养时间的延长病毒滴度逐渐提高,7296h时几乎达到高峰,这与显微镜观察细胞病变悄况相吻合。随着培养时间的延长.细胞逐渐变圆、坏死并从培养板脱落,大部

27、分接种病毒的细胞都在96h左右完全从培芥板脱落，因此此时HA滴度也最高。此后随着培养时间的延长，HA滴度儿乎没有明显变化.甚至降低.可能是因为病毒在37无培养时间过长会影响其存活和生长的原因。1.3 AIV病毒接种浓度对HA滴度的影响比较了3株病毒1：104和1：105稀释的接种效果，结果表明当接种病毒浓度为1：104时培养液上清的HA滴度出现较接种病毒浓度为1：10早约24h.培养72-96h,当胰蛋白酶浓度为540dg/ml时.各相应的病毒接种浓度之间差异不显著。3.4病毒株的致病力与HA滴度的关系该研究表明，同时进行的试验中致病力较强的"W株AIV病毒在相应的试验中所产生HA滴

28、度均低于HN(M株和WD98株。另外，该毒株的相应HA滴度产生的时间也较另外2个毒株晚24h左右，其原因尚不清楚。这也说明不同毒株的培养条件不尽相同，在制备抗原时需要针对不同的毒株进行相应的培养条件研究。参考文献1毕英佐.H9N2亚型禽流感的流行现状和防制措旌J.中国家禽,2009.31(11):33-34.2 周蚊.世界主要禽树流做状J.中国家®.2007.29(4):1-4.3 叶柱御，胡江锋.H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展工.动物医学进,2008,29(2):89-92.4 KTSTNER0.BARRETTPN,MUNDTW.elal.Devrlopmwn<»fajnammali-ancell(Veto)derivedcandidateinfluenzavirusvaccine_J.Vaccine,1998.16(9/10):960-968.5 KE11CHIMAKIZUMI.KAZUHIKOK1MACHI.K.ATSLH1KOFVKADA,ctal.TimelyproductionofA/Fujian-likeinfluenzavaccinematchingtlx?2003-2004epidemicstrainmayh