采用多种抗原测定静注人免疫球蛋白(pH4)中抗体Fc段生物学活性的初探.docx

1、论著.采用多种抗原测定静注人免疫球蛋白(pH4)中抗体Fc段生物学活性的初探席亮，钱秋娟，张继鹏,赵一欢，刘晓，何彦林(兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046)摘要：目的初步探讨采用多种抗原测定静注人免疫球蛋白(IVIG)(pH4)中抗体的Fc段生物学活性，了解IVIG中抗体的Fc段生物学活性。方法采用补体活化的经典途径中免疫复合物激活补体的方法，将不同浓度的麻疹病毒、风疹病毒、乙肝表面抗原(HBsAg)、破伤风类毒素、脑膜炎球菌P64k外膜蛋白和白喉类毒素6种抗原分别致敏人0型血红细胞形成红细胞-抗原结合物;然后,6种致敏红细胞分别与IVIG孵育，与特异性

2、抗体形成红细胞-抗原-抗体复合物;最后,此复合物与补体反应，在541nm波长处读取吸光值，并绘制溶血反应动力学曲线,分别计算IVIG中针对上述6种抗原IgG的Fc段生物学活性。采用此方法，用6种抗原致敏的红细胞测定IVIG的Fc段生物学活性10次，验证此方法的重复性。结果麻疹病毒、风疹病毒、HBsAg、破伤风类毒素和脑膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的红细胞分别与供试品和补体反应后，测定的溶血反应动力学曲线较平缓，而白喉类毒素致敏的红细胞与供试品和补体反应后，测定的溶血反应动力学曲线下降明显，呈典型的“S”型曲线。计算结果显示,IVIG中针对此六种抗原的抗体Fc段生物学活性相对于参考品均大于80%

3、。Fc段生物学检测方法重复性较好。结论采用多种抗原分别致敏红细胞，可以用来检测1VIG中多种抗体的Fc段生物学活性，为深入了解IVIG制品中的多种抗体的Fc段生物学活性奠定了基础。关键词：抗原;静注人免疫球蛋白;Fc段;生物学活性中图分类号：R392.33文献标志码：A文章编号：1005-5673(2012)06002505DeterminationonbiologicactivityofFcfragmentinintravenousimmunoglobulin(pH4)byusingmultipleantigensXILiang,QIANQiu-juan,ZHANGJi-peng,ZHAOY

4、i-huan,LIUXiao,HEYan-lin(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd,9CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTodeterminebiologicactivityofFcinIVIG(pH4)byusingdifferentantigensfandtounderstandbiologicactivityofFcfragmentofvariousIgGinIVIG(pH4).Methods

5、TheclassicalcomplementactivationwascarriedoutindetermininationbiologicalactivityofFcfragmentinIVIG(pH4)byusing6differentantigenscoupled-tannedredbloodcells(RBC),respectively.FirstfItisbypreparationofmeaslesvaccines,rubellavaccinesfHBsAg,tetanustoxin,P64koutermembraneproteinofMeningococcusanddiphther

6、iatoxincouplingtoRBCrespectively.ThenIVIGwereaddedtotheantigencoupledRBCtoformacomplex(antigensensitizedRBCandantibody).Finally9thecomplementwasaddedtothecomplex.MeasurementbiologicactivityoftheFcwasbymeansofdetectionin541nmandmakingcurvesforhaemolysis.Analysiswasperformedfor10timesbyusing6different

7、antigenwithdifferentconcentrationcoupledRBCfrespectively.VerificationwascarriedoutinconfirmationoftherepetitionforbiologicactivityofFcinIVIG.ResultsThehaemolysiscurveswereinslopelinesfor5differentantigens(measlesvaccines,rubellavaccinesfHBsAg,tetanustoxin,andp64kproteinonoutermembraneproteinofMening

8、ococcus)coupledRBC.However,haemolysiscurvefordiphtheriatoxoidcoupledRBCwasverytypicalandformedaclassical"S"curve.ThebiologicactivityofFcfragmentinIVIGcouldreachtomorethan80%byusingof6differentantigensincomparisonof收稿日期：201210-17；修回日期：2012-11-05referencematerials.Thetestforrepetitionofbiolo

9、gicactivityof作者简介:席亮(1970-),男，医学生物学工程师，主要从事生物FcinIVIGwasinanormalrange.ConclusionDetermination制品质量保证工作。onbiologicactivityforFcfragmentinIVIGwasattemptedby通信作者:刘晓,E-mail：boylxl006usingmultipleantigensinthisstudyfwhichprovidedaprimarybasisinthisaspect.Keywords：Antigens;IntravenousImmunoglobulin(IV1G);

10、Fcfragment;Biologicactivity静注人免疫球蛋白主要成分为IgG。IgG最主要的生物学功能是对微生物的调理作用。调理作用是微生物特异结合的抗体通过完整的IgG的Fc段与吞噬细胞的Fc受体结合，形成抗原抗体吞噬细胞的复合物，促使吞噬细胞对微生物的吞噬。所以，正常的调理作用需要IgG识别吞噬细胞表面Fc受体，这首先要求IVIG中IgG要有完整的Fc段生物学活性。另外JVIG对自身免疫性疾病的免疫调节机制也往往通过Fc段来完成,包括效应细胞Fc受体的竞争性抑制、抑制性FcyRflB受体的诱导及FcRn受体饱和作用等。因此,IVIG的Fc段在体内能否发挥良好的生物学活性与临床疗效

11、密切相关。生物制品的生物学功能应通过临床试验来证实，但是一些体外检测指标也能间接证实其生物学活性。为体外检测IVIG制品临床应用的有效性,1997年欧洲药典已将1VIG的Fc段活化补体的功能作为质控指标来考核制品的质量。中华人民共和国药典）2010年版三部也已介绍了Fc生物学活性检测方法。欧洲药典和中华人民共和国药典介绍的Fc段生物学活性的检测方法基本一致，只能检测针对某一种抗原的抗体Fc段生物学活性。这样仅能了解IVIG中针对特定一种抗原的抗体生物学活性。为了解针对多种抗原抗体的Fc段生物学活性，一种途径可以选择多种抗原分别致敏红细胞;第二,可以选用多种抗原的混合物致敏红细胞;另外，可以采用

12、IgG的Fc能够与吞噬细胞表面的Fc受体结合的原理来测定IVIG中抗体的Fc段的生物学活性，此种方法能够测定IVIG中所有抗体的Fc段生物学活性，这对于体外评价IVIG的有效性更有利。基于目前IVIG的Fc生物学活性检测方法和实验条件的限制，为了能够观察IVIG中针对多种抗原的抗体Fc段生物学活性，研究选用6种抗原分别检测IVIG中抗体Fc段生物学活性，期望能更全面地了解IVIG中针对多种抗原IgG的Fc段生物学活性。1材料和方法1.1试剂与仪器磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠、单宁酸（鞋酸）和氯化铭均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司；巴比妥钠购自Sigma公司；

13、牛血清白蛋白购自上海伯奥生物科技有限公司;U-2001型紫外分光光度计为HITACHI公司生产;ModelJ-6M型离心机购自Beckman公司；HZS-H型恒温水浴振荡器购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;1VIG参考品为随机抽取兰州生物制品研究所有限责任公司（以下简称兰州公司）生产的一批IVIG（pH4）以IVIG（pH4）国家标准品为参考品自行标定的工作标准品，批号为R20120503,蛋白含量为50g/L；麻疹疫苗和风疹病毒由兰州公司疫苗一室提供;破伤风类毒素和脑膜炎球菌外膜蛋白P64k抗原由兰州公司第一研究室提供；白喉类毒素由兰州公司菌苗一室提供;乙肝表面抗原由兰州公司血液制剂室保

14、存；人。型血由定西兰生单采血浆有限公司岷县站提供;补体采用豚鼠血清，由兰州公司血液制剂室自行采集制备，补体效价为150CH50/mL；供试品为随机抽取的兰州公司生产的!VIC（pH4）o1.2方法1.2.1 6种抗原致敏红细胞的最佳浓度优化分别用原始浓度、2x稀释和4x稀释的6种抗原样品致敏红细胞，然后采用1.2.2介绍的方法测定其与补体反应的溶血反应动力学曲线，寻找抗原致敏红细胞的最佳浓度。1.2.2 IVIG的Fc段激活补体的溶血反应动力学曲线测定依据文献2介绍的方法,首先用20mLPBS（pH7.2）洗涤人。型血红细胞3次，再用1.3mg/L糅酸糅化红细胞，采用10%氯化铭将适当浓度的不

15、同抗原包被到红细胞上，即为致敏红细胞,致敏红细胞浓度须在紫外分光光度计541nm处用牛血清白蛋白巴比妥缓冲液调节吸光值至1.0±0.1；按照表1的用量准确取供试品、参考品和阴性对照（阴性对照用牛血清白蛋白-巴比妥缓冲液代替）加入致敏红细胞孵育30min,用牛血清白蛋白.巴比妥缓冲液洗涤3次，用0.8mL的牛血清白蛋白-巴比妥缓冲液重悬统细胞。于红细胞悬液中加入75CH50/mL补体后，抗体Fc段就会与补体结合,引发补体反应，最终导致血细胞的细胞膜受到攻击,血细胞破裂，释放出血红蛋白。加入补体后,立即在紫外分光光度计上541nm波长下记录阴性对照、参考品和供试品的初始吸光值（4,）,然

16、后每分钟记录1次紫外吸光值（妇）。表1WIG的Fc段生物学活性测定各样品的用量（mL）Tab.1VolumeofallsamplesusedindeterminationonFcfunctioninIVIG试验组致敏红细胞参考品供试品缓冲液补体参考品组0.10.9/0.2供试品组0.1/0.9/0.2阴性对照组0.1/0.90.2X参考品FC段生物学活性X100%时间A6424286阴性loooccibso-*-5(M)CCID5O-M-250CCID50141210810一阴性-1(MM)CC1D5O-5()OCC1D5M-M-2S0CCID500601201802403003r>04

17、2048。54060066072078084090()时间/s48642A：麻疹病毒;B：风疹病毒;C：乙肝表面抗原;D：破伤风类毒素;E：脑膜炎球菌P64k蛋白；F：白喉类毒素图1使用不同浓度抗原致敏红细胞与IVIG结合后分别与补体反应的A即时间（s）溶血反应动力学曲线Fig.1HaemolysiscurvesforinteractionbetweencomplexofdifferentantigenscoupledRBCandIVIGandcomplementbytime1.2.3IVIG的Fc段生物学活性的计算在Excel中制作出4“时间（s）的溶血反应动力学曲线，并计算出各曲线中相邻三

18、点连接成直线的最大斜率S.P，并根据下述公式计算IVIG的Fc段生物学活性（IFc）。二供试品sy人一阴性对照sy4参考品Sex/1阴性曲线Sex/42结果2.16种抗原致敏红细胞的浓度优化结果在图1AE中，麻疹病毒、风疹病毒、HBsAg、破伤风类毒素和脑膜炎球菌的P64k蛋白致敏的红细胞与供试品和补体结合反应后，测定的溶血反应动力学曲线都比较平缓。而图1F显示，白喉类毒素致敏的红细胞与同一供试品和相同浓度的补体反应后测定的溶血反应动力学曲线明显下降，典型的“S”型曲线。从图1可以看出,6种抗原分别以不同的浓度致敏红细胞与补体的溶血反应动力学曲线有差别。IVIG的Fc段生物学活性测定方法要求测

19、定的溶血反应动力学曲线能够计算出曲线相邻三点的最大斜率即可用于计算Fc段生物学活性。麻疹病毒、风疹病毒、HBsAg、破伤风类毒素、脑膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的红细胞与补体反应后测定的溶血反应动力学曲线较平缓，而白喉类毒素致敏红细胞与补体的溶血反应动力学曲线呈典型的“S”型曲线。由于麻疹病毒、风疹病毒、HBsAg、破伤风类毒素和脑膜炎球菌P64k外膜蛋白5种抗原浓度的限制,试验中以上5种抗原的浓度均采用最高浓度用于后续试验。而白喉类毒素使用150Lf/mL,但是试验没有对更高浓度的抗原致敏红细胞进行详细的研究。2.26种抗原致敏的红细胞测定IVIG的Fc段生物学活性结果表2为使用6种抗原致敏

20、的红细胞测定供试品的Fc段生物学活性情况，结果显示,6种抗原的致敏细胞检测供试品的Fc段生物学活性结果均高于80%。但是测定的同一批样品的Fc段生物学活性结果差别较大，可能是由于供试品中针对此类抗原的抗体滴度差别造成的。表2分别用6种抗原致敏的红细胞测定WIG的Fc段生物学活性Tab.2TheresultsofbiologicalactivityofFcfragmentinIVIGbyusingdifferentantigenscoupledRBC抗原供试品Fc段生物学活性麻疹病毒117风疹病毒132乙肝表面抗原98破伤风类毒素82P64k蛋白118白喉类毒素1292.3采用6种抗原测定IVI

21、G的Fc段生物学活性的重复性.采用6种抗原致敏的红细胞分别测定IVIG的Fc段生物学活性10次，以考察采用此方法测定IVIG的Fc段生物学活性的重复性，更进一步验证结果的可靠性。表3所列数据显示,6种抗原致敏的红细胞测定IVIG的Fc段生物学活性结果较稳定。表3采用6种抗原致敏的红细胞测定IVTG的Fc段生物学活性试验Tab.3TheresultsofbiologicalactivityofFcfragmentinIVIGbyusingdifferentantigenscoupledRBCintested试验次数F。段生物学活也）麻疹病毒风疹病毒乙肝表面抗原破伤风类毒素P64k蛋白白喉类毒素1

22、1091349986109972108123878711298399109888010911441001129690107945113108868611189610912097921029671141089084107109811111883891061039104104828711410210951249181112101x±s106±6.1116±8.683±8.986±3.6109±3.4100±6.33讨论20世纪40年代,Cohn-Oncley建立了适合工业化规模分离免疫球蛋白（IgG）的低温乙醇法分离工艺，用该工

23、艺分离的IgG最初不能用于静脉注射，原因是会产生严重的副反应。这种副作用主要是与制剂中存在抗补体活性（ACA）有关。随后IVIG的研制工作开始关注防止、减少ACA方面。于是，应用胃酶或纤溶酶消化（酶解法）及化学修饰法减少ACA的方法相继产生。但是，这些方法均会破坏IgG的结构完整性，因而降低了IVIG的疗效。要作用。20世纪80年代，人们开始开发天然、完!应齐全，其含量与正常人血清IgG亚类分布相近，不=1IVIG的临床疗效与其生物功能密不可分,IgG分子的各个结构域在机体的免疫反应中均发挥着重的具有生物学效应的IVIG0理想的IVIG应具有与天然IgG相同的属性,在制备IVIG过程中,IgG

24、亚类应破坏其生物活性。由于IVIG的生产工艺中很多工艺步骤会影响IgG的Fc段生物学活性，所以建立IVIG的Fc段生物学活性的检测方法是十分必要的。国内王誓舟等在2003年就已经建立了检测方法，该方法已经在中华人民共和国药典2010年版三部中收载，但是在IVIG的Fc段生物学活性日常检测中还受到很多因素的影响,并且该方法仅能检测IVIG中一种抗原特异抗体的Fc段生物学活性。为尽可能地全面了解IVIG中多种抗原特异抗体的Fc段生物学活性,研究分别采用麻疹病毒、风疹病毒、乙肝表面抗原、破伤风类毒素、脑膜炎球菌P64k蛋白和白喉类毒素6种抗原来测定兰州公司生产的IVIGFc段生物学活性，为保证IVI

25、G质量提供了参考依据。研究显示,采用麻疹病毒、风疹病毒、乙肝表面抗原、破伤风类毒素和脑膜炎球菌P64k蛋白作为抗原，测定的溶血反应动力学曲线较平缓，可能因为IVIG中针对这些抗原的抗体水平较低。但白喉类毒素作为抗原测定的溶血反应动力学曲线下降明显，是典型的“S”型曲线。通过计算,6种抗原的致敏细胞检测供试品的Fc段生物学活性结果均高于80%o另外，在此基础上,分别用6种抗原致敏的红细胞检测10次IVIG的Fc段生物学活性，结果显示此检测方法重复性良好。研究选用了6种抗原来检测IVIG的Fc段生物学活性，国内外有些学者也曾选用不同的抗原来进行检测，但采用乙肝表面抗原和脑膜炎球菌P64k外膜蛋白为抗原致敏红细胞测定供试品Fc段生物学活性的研究在国内外还未见报道。Vroljak等使用破伤风类毒素作为抗原来检测人免疫球蛋白的Fc段生物学活性，检测方法准确度较高。王菁舟等研究了使用风疹抗原、麻疹抗原、流行性腮腺炎抗原和白喉类毒素检测人免疫球蛋白的Fc段激活补体的功能，研究结果显示，无论使用何种抗原，只要抗原效价为1：64J:128和1：256,所得的溶血反应动力学曲线均为一条直线，而用效价为1：512的抗原进行试验得到较好的溶血反应动力学曲线。欧洲药典推荐使用风疹病毒作为抗原来检测,中华人民共和国药典推荐致敏红细胞的抗原使用白喉类毒素或流行性腮腺炎病毒，说明抗原的选择应该考虑