采用腺病毒作为猪用疫苗的研究进展载体.docx

1、采用腺病毒作为猪用疫苗的研究进展载体智海东（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001）DOI:10.3969/J.ISSN,1671-6027.2012.03.002疫苗是兽医学中最有效和最便宜的预防工具。现实的兽医领域不仅理想的疫苗很少，许多疫苗效力有限或布毒副效应，而旦仍有一些严重疾病尚无有效疫苗。传统的疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗。近期已采用基因工程技术改进和设计新型疫苗。腺病毒可诱导抗插入外源基因编玛抗原的体液、黏膜和细胞免疫应答，现已成为表达和运送外源免疫蛋白的候选载体之一，用于开发各种动物的疫苗，尤其是猪用的载体疫苗。本文总结了作为猪用载体疫苗的研究进展以及腺病

2、毒载体的生产和纯化进展与策略。1引言传统免疫使用的疫苗灭活疫苗、弱毒疫苗或亚氓位疫苗。灭活疫苗也称“死苗”，含有处理过不能夏制的微生物，它们不能在细胞质中刺激蛋白产生，因此病毒抗原不能被MHC-I类分f呈递，不能产生细胞毒性CD*T细胞。弱毒疫苗在诱导包括细胞毒性CD"T细胞在内很大数觉的相关效应机制方面通常效力较高，但弱毒疫苗有时有残余毒力.或通过突变成为有致病性的推株重新出现。亚单位疫苗本身要比依靠整个微生物制备的疫苗安全，但是它们的免疫原性不强,在诱导MHC-I类特异性应答上很困难。因此疫苗研发仍是免疫学的一个重要目标。目前还需要进一步改进现有疫苗的不足来减少疾病对动物生产的经

3、济影响。理想的疫苗应在预防感染中100%有效，但现实并非如此。一种疫苗.应在单次接种后的数日至儿周内能提供超过90%的保护力，就是非常好的疫苗了。为了降低再免疫带来的成本，应该研制-种接种次数最少、免疫持续期最K的免疫程序°多数病毒是通过黏膜表面入侵的，因此，通过黏膜途径运送，即鼻内或口服运送应作为疫苗设计的首选。疫苗应该安全不引起任何副反应，比如免疫抑制或干扰同时接种其它疫苗的免疫应答。当然，理想的疫苗还应具备遗传和热稳定性。遗传稳定是确保疫苗病毒毒力不会返强的基础；由于疫苗从生产到运送并不总是能维持在冷链中，因此热稳定性显得尤为重要。若疫苗能够在幼龄时接种.即先天免疫和被动免疫存

4、在时进行，最为理想。理想疫苗最为重要的特点就是高效和低成本,也是疫苗研究迫寻的目标。腺病毒（Ad）是免疫原性很强的高效疫苗载体，町诱导对Ad载体表达抗原特异的CD"和CD*-T细胞的能力。虽然对Ad免疫后免疫应答的动力学和本质的了解很少，但已发现Ad载体具有：（1）运送大最抗原至淋巴组织的能力；（2）诱导CD8*T细胞的快速扩增,并迁移至整个淋巴组织的能力;（3）产生持续和高水平的CVT细胞应答的能力。采用rAd作为兽用疫苗有许多优点：（1）它们可以感染很大一类分裂或非分裂细胞;（2）Ad感染随处可见，通常并不引起显著或严戒地临床症状；（3）它们可经口服接种；（4）对Ads的基因组已

5、研究的很明确；（5）它们可容纳36kb的外源基因；（6）它们的基因组很少整合入宿主染色体;（7）现在构建rAd载体的技术已很成熟；（8）它们可在互补细胞系上复制，并达到很高的滴度。2Ad生物学Ad是6090nm无囊膜的20面体病毒,有大约36kb的线性双链DNA基因组。根据病毒染色体基因组复制的前后，可将其基因组分为早期（E）和晚期（L）表达基因。E1基因产物涉及控制病毒基因的转荥,关闭细胞蛋白和细胞转化。E2基因编码的蛋白涉及病毒复制，包括涉及DNA延长的I个DNA结合蛋白（E2A）和1个DNA聚合酶（E2B）；E3基因对Ad的复制必不可少，编码干扰宿主抗病毒感染免疫应答的蛋白；地后E4基因

6、涉及由早期到晚期基因表达的转换，关闭宿主细胞基因的表达,病毒复制并组装成病毒粒子。第一代载体通常缺失它们的E1和E3区.可是当在293细胞生产时，在第一代Ad载体的左末端与细胞基因组中与E】基因序列部分重叠的区域之间会发生重组，导致产生E1阳性复制全能的Ad（RCA）,如果想要非岌制型载体这是个重要的安金性问题。第二代载体是复制缺陷型Ad,进一步的缺失了E2A、E2B或E4,免疫原性和RCA产生均下降，但是构建与这些载体互补稳定细胞系的操作非常繁琐，导致细胞生长差病毒滴度低。rAd载体已被开发为发制全能型的载体，将外源抗原的表达盒替代E3基因，或作为复制缺陷型病毒,用抗原表达盒来替代E1基因。

7、尽管更偏向于采用复制缺陷型病毒.但不同的研究支持在兽医上采用RCA,因为报道在免疫后复制缺陷型病毒诱导黏膜免疫和保护抵抗呼吸道攻击的能力有限。现已知依麻RCA的疫苗具有克服母源获得免疫的潜力。3腺病毒用于猪的免疫3.1猪瘟痛毒猪瘟（CSF）是猪的一种严如的病毒性传染病死亡率很高.在猪和野猪密度高的地区很难控制，在集约化养猪地区是最重要的疾病。因此被列为国际贸易中最重要的A类传染病。当前在世界很多地区仍进行预防性免疫，因此急需开发出在家猪和野猪中能控制CSFV的高效疫苗。新型疫苗研发包括采用不同策略来运送主要囊膜盅白E2,多数的中和抗体抗E2蛋白。Hammond等构建了首株表达E2蛋白的rPAd

8、,并采用lOVCIDJ动物在组织培并上清中以单剂快接种。当皮下接种时，可足够完全保护猪抵抗皮下攻击。后来又发现采用口服攻击时.仅有60%的动物得到保护，近期研究结果表明采用rPAd以1(YTODJ动物给猪口服免疫2次，可获得彻底的保护。3.2伪和犬痍卓伪狂犬病毒(PrV)是一种a疱疹病毒.可在猪上引起经济性更要和广泛传播的伪狂犬病cPrV是一种高度嗜神经病毒，可在其天然宿主猪以及很大类其它动物种类引起神经系统与呼吸道的并发症。现已普遍采用弱毒疫苗或全病毒灭活疫苗来进行抗伪狂犬病的免疫°可是新生动物的免疫经常受到母源抗体存在的影响.抑制对此两种疫苗的免疫应答。采用构建的携带单个PrV基

9、因的rAd疫苗可作为一个安全替代。PrV的慵蛋lilgB.gC和gD在诱导抗病毒感染的保护性免疫应答中起亟荽作用，因此成为候选蛋白。现已表明采用携带此3个基因复制全能的HAd5以1砂IO“TCJDa/动物给小猪在出生后IH龄进行肌肉接种，无论有无母源抗体，产生相似的中和抗体应答，在16周后攻毒仍可获得部分保护。对于在出生后数月就宰杀的猪来讲，出生时免疫一次即可提供足够持续期的保护“最后采用2mL含有WqCIDe表达PrVgD基因rPAd的澄清组织培养液上清经皮下免疫2次,可保护猪抵抗攻击。病理剖检在免疫-次猪的肺脏寺可见的肺炎损伤，而在免疫两次猪的肺脏则无病变。3.3口玷疫痈毒口蹄疫(FMD)

10、是种在包括家养反刍兽、猪和超过70多种野生动物偶蹄件的严重的、临床急性、水泡样疾病。一只猪可在很短时间内释放相当于3000头牛产生的气雾病毒,因此猪被当作此病传播的个重要因素，当在一个有商密度免疫空白动物的无FMD国家暴发FMI)时，其经济和社会影响可以说是灾难性的。当前的疫苗是采用浓缩的病毒感染细胞培养上清经化学灭活的制备物“可是无FMD国家通常禁止使用疫苗.因为缺乏可切实将免疫动物与感染动物区分出来确定的诊断检验。现有疫苗仅可在免疫后大约7日诱学保护性应答，这对于无FMD国家非常重要，一旦FMD暴发.迅速控制并预防疾病传播是最关键的。因此需要开发出依靠迅速诱导保护的疾病控制策略.Mayer

11、等构建了株复制缺陷型HAd5载体,含有来FMDVA12株的核衣壳多肽P1和病毒3C蛋白酶编码区域，这对于将P1加工为衣壳蛋白VP0.VP3和VP1是必须的。他们观察到以1x10*PEU/动物在PBS中给猪免疫.产生抗FMDV结构果白的抗体和FMDV特异性的中和抗体应答，在初免后4周再采用5xIWFU/动物在PBS中进行第二次免疫抗体会稍微加强。此免疫程序可给猪提供显著程度地保护.6头猪中有5头彻底保护，另外】头的发病症状显著减轻。后来Moraes等表明采用表达来自FMDVA24株P1编码区的复制缺陷型HA(I5以5x10WU/动物在PBS中接种一次，可在免疫后的7、14或42日完全保护猪抵抗同

12、源强谁的攻击。因为有效的免疫是祢株依赖的，采用-种血清型感染并不能提供对另一种的保护，因此乂开发出了»Ad5的双顺反于载体疫苗.这降低了开发多价FMD腺病毒载体疫苗的成本。为了构建这些载体，采用了来自FMDVA24株和01株的核衣壳蛋白编码区P】以及A12株的3C蛋白酶编码区。可是采用双顺反子疫苗以2.5x10WFU/动物在PBS中免疫，诱生的中和抗体应答要比商品化FMD疫苗或单价Ad-A24疫苗诱导的应答明显低。根据FMDV对干扰素(IFNa/B)高度敏感的情况，近期采用复制缺陷型HA<15开发出了一个新型策略。现已表明以10TFU/动物免疫后的24h采用FMDV强毒进行攻击

13、，此策略可获得完全的保护。3.4猪繁殖与号甄侏合征痛毒猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种经济性很重要的猪的传染病，在全球分布，以修猪生殖失败和未断奶仔猪和生长猪的呼吸道疾病为特点。感染猪和清洁猪的在接接触是PRRSV传播的主要途径。由PRRSV感染导致的肺炎在青年猪要比成年猪更严重，若并发细菌感染会更夏杂oGonin等观察到在PRRSV感染猪体内存在的与中和作用有关的循环抗休主要针对GP.囊膜蛋白。Gagnon等构建了一株表达Gl蛋白的复制缺陷型HAd5,并采用此毫组病毒以5x1伊xlOTFU/动物在含有IOOjaLPBS和100aL浓度为0.02%沙姆1017的混合物给猪进行2次肌肉注射。

14、发现猪在加强免疫后14d进行鼻内病毒攻击时.已产生了高水平的抗GP,蛋白抗体。而且免疫猪呈现出特异性的免疫记忆应答，在PRRSV感染后，导致针对其实病毒GP,蛋白的中和性表位记忆细胞快速的克隆增殖。3.5传染性胃炎痈*传染性胃肠炎病毒(TGEV)nf感染新生仔猪的肠道和呼吸道组织，导致接近100%的死亡率。TGEV感染上皮细胞并在一些情况下可感染肺脏巨噬细胞。现已开发出儿种灭活和致弱的商品化TGEV疫苗.这些疫苗都不能对仔猪提供完全保护，现正在尝试开发有效的重组TGEV疫苗°现已鉴定纤突S蛋白是TGEV中和抗体的主要诱生物，并介导TGEV结合于其细胞受体上。这样表达S蚩门的HAd5被

15、构建出来并用于研究诱生抗体对猪的保护。现观察到采用此重组病毒以10WU/动物在PBS中免疫猪获得的猪血清，在给易感猪接种致死剂虽强毒之前与之混合，经口服接种病帝血清混合物可预防TGEV强毒的复制，彻底保护猪不出现症状和死亡。而旦使用的剂量并未在超过50只的接种猪上出现任何临床症状并持续至接种后10周，提示此载体可被用于猪的活疫苗而不引起任何与载体有关的次级并发症°PAd载体应比HAd更有效。Tuboly和Nagy构建了表达TGEVS蛋白的rPAd5,采用此重蛆病茬以5xIbPFU/动物的剂量经单次口服免疫,可足够诱导系统和局部的体液免疫应答可惜并未进行攻毒试验C3.6猪沆感疯塞猪流感

16、病毒(SIV)是一种在家禽、猪、海洋哺乳动物和人等不同物种中广泛传播的重要病原体。在猪上流感作为一个群的传染病,或更通常引起ARI)的暴发。虽然很少致命，猪流感对经济具有潜在的影响。当前对SIV和PRRSV的混合感染更加关注。除了猪流感对养猪业的影响之外，猪对A型流感病律在人上的全球生态学非常逾要。现在已经商品化的SIV疫苗有全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。虽然这些疫苗会降低发病率和临床上疾病的严重性,但他们不能持续提供抵抗病毒感染的完全保护。2株复制缺陷型HAd5被开发出来作为抗SIV潜在的疫苗,表达流感病毒H3亚型HA的rHAd5可主要诱导亚型特异为主的体液免疫应答，而表达核衣壳蛋白（NP）的

17、rHAd5可群特异性地刺激对所有血清亚型A型流感病毒提供交叉反应免疫的细胞毒性T淋巴细胞。并且观察到采用上述首株重组病毒以5xIgCID%/动物在PBS中给小鼠免疫，以2x10"CIDJ动物在PBS中给猪免疫，在免疫后4周可诱导高水平的抗SIV的病毒特异性HI抗体，并给动物提供部分保护。而另一方面以2xKTTCIDJmL在PBS中的2种重组病毒混合物给猪免疫，可提供完全保护。4作为兽用疫苗腺病毒的生产与纯化当开发成本有效的粹用疫苗时过程设计很关键,如果准备进行工业化应用减少步骤过程是一个前提。目前并未要求兽用疫苗要达到人用疫苗最终那样的纯度，这会在纯化方案中有所体现。在兽医上应用的A

18、d疫苗主要采用传代细胞系比如293、MDBK、VRlBL、HeLa和A549来生产。在细胞增殖步骤.一般采用不同的动物血清来提高细胞生长。可是在细胞培养基中添加这样的成分存在几种缺陷,比如批次之间的不同，被外源病毒、支原体和阮病毒等污染的可能风险。当前欧洲（EMEA）和美国（FDA）的管理机构鼓励生物制品厂在生产过程中减少或取消动物源性材料的使用。近期有几种无血清和无蛋白培养基已经商品化。虽然使用这样确定的培养基仍然很贵，但大规模生产Ad载体会要求使用这类培养基以便于下游加工，而且时间长了会降低整个过程成本。根据使用黏附或悬浮培养细胞的类型生产方法有所不同。从生产上讲，悬浮适应细胞系更便于大规

19、模生产。现已开发出Ad生产的不同操作模式：（1）批模式，提供了最简易的操作方式,无需额外补料，降低了污染的风险;（2）补料模式，容易操作与规模化，通过补充有限的营养或减少有毒代谢物的积累，延长培养的生命周期；（3）灌注模式，细胞可以相对高的密度在生物反应器内迟滞.而新鲜营养供应和代谢产物移出同时进行。对Ad市场需求的增加要求生产浓缩Ad载体方法的成本必须很低。Ad具有生产很高滴度的优势（10，。10“PFU/mL）,可在很大比例的接种动物中诱导很好的免疫应答，尤其黏膜免疫需要使用的剂量大，因此对培养体积有要求。为了提高产量很明显必须进行进一步的过程研发。在生产体积上的改进可通过增加被感染细胞的

20、浓度来实现，而不降低产品的特异性产录，可是在批次操作生产中Ad载体维持的最大的特异性生产率被限制在细胞密度为Ix106细胞/mL的范围°现已经制定了几种方案来克服所谓的“细胞密度效应”。Gamier等证实在感染时替换培养基并在感染后24h添加简萄糖，间断性调节pH值，允许维持最大的特异性生产率在1.6x106细胞/mLo而Nadeau等通过在感染后24h添加必需氨基酸来进一步改进此策略.稳定体积生产率在细胞密度为2X1063xW细胞/mL之间。此结果提示在细胞密度高时存在着基质限制和/或副产品抑制。灌注操作模式已经被尝试作为一种控制培养环境和移除有毒副产品的手段。在感染后2d采用灌注

21、率为每日2个反应器体积，最大特异性生产率仅可被维持在感染细胞密度为3X106细胞/mL,但更换培养基的体积大却大大地提高了生产成本。在Ad生产中感染动力学很重要，必须对一些变段进行研究。比如感染最（MOI）和在过程中优化收获时间对于增加产品产量来讲很重要.可避免快速消耗成本和经鉴定的种毒库，并确保在不同生产规模间的感染动力学是可重复的°在大规模生产中采用低MOI受到欢迎因为可省略病春接种的中间步骤。最后应采用最少的步骤来对兽用制品进行纯化,而且采用的单元操作应简单而便宜。传统上在实验室纯化rAd是采用两轮氯化镇（CsCl）密度梯度超速离心。可足CsCl密度梯度方法不能规模化。色谱层析纯化、离子交换、疏水作用、金属螯合和尺寸排除层析已被用于评价捕捉和纯化HAd5oKamen和Henry开发/一种复杂和昂贵的用于基因治疗载体的纯化方法。虽然此方法可对Ad载体进行大规模纯化并使其纯度达到CsCl梯度超商方法所得纯度，可是显著地增加了终产品的