血小板源生长因子对大鼠肝星状细胞增殖和胶原及血小板源生长因子基因表达的影响

1、    血小板源生长因子对大鼠肝星状细胞增殖和 胶原及血小板源生长因子基因表达的影响        摘要目的证实血小板源生长因子(PDGF)对体外培养大鼠肝星状细胞增殖和胶原基因表达及PDGF自分泌的作用。方法（1）采用完全无血清培养，用3H-TdR掺入检测了PDGF、转化生长因子1(TGF-1)和表皮生长因子(EGF)对肝星状细胞的DNA合成作用；（2）应用Northern分子杂交检测了PDGF对肝星状细胞的、型前胶原及PDGF-B等mRNA表达水平的影响。结果P

2、DGF、EGF均可剂量依赖性地刺激肝星状细胞增殖，其作用在0.510 ng/ml之间呈剂量依赖性增强，剂量大于10 ng/ml时，促DNA合成作用达到饱和。但PDGF的作用更强。而TGF-1在本实验条件下对肝星状细胞的增殖没有影响。PDGF可提高肝星状细胞的、型前胶原和PDGF-B的mRNA水平，且前胶原mRNA的改变呈时相性变化。给予PDGF刺激12 h，见型前胶原mRNA表达已有增强，随后下降，至48 h 型前胶原mRNA表达显著增强；型前胶原mRNA水平在添加PDGF 12 h即见表达增强，随后下降，48 h再度低水平增强。体外培养大鼠肝星状细胞可表达PDGF-B mRNA，给予PDGF

3、-BB刺激6 h后，可见PDGF-B mRNA表达增强23倍，至24 h恢复到刺激前水平。结论PDGF可以促进肝星状细胞的增生和表达胶原，后者的时相改变可能与PDGF自分泌有关。关键词血小板源生长因子；胶原；基因表达调控；肝硬化Effects of platelet-derived growth factor on the proliferation of hepatic stellate cells and their expressions of genes of collagens and platelet-derived growth factorLIU XuesongZHANG Ji

4、nshengZHANG Yuee.（Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China）AbstractObjectiveTo investigate the effects of PDGF on the proliferation of rat HSC, its gene expression of collagens and the autocrine excretion of PDGF in vitro. Methods3H-TdR incorporation was used to e

5、stimate the DNA synthesis elicited by PDGF, TGF-1 and EGF in HSC cultured in an absolutely serum-free medium. Northern blot was employed to detect the levels of mRNA expressions of type and procollagens and PDGF induced by PDGF added in the same medium for HSC. ResultsBoth PDGF and EGF enabled to st

6、imulate the proliferation of HSC in a dose-dependent manner, and the effect of the former was stronger. The proliferation was dose-dependently increased in PDGF and EGF with a dosage between 0.5 and 10 ng/ml, and the synthesis of DNA became saturated when the dosage was over 10 ng/ml. TGF-1 gave no

7、effects on the proliferation of HSC under current experimental condition. Furthermore, PDGF was able to enhance the mRNA expression for type and procollagens and PDGF itself. The promoting effect for the expressions of type and procollagen mRNAs by PDGF was bi-phasic between 6 to 48 hours of the cul

8、tivation. For type procollagen, mRNA expression began to increase 12 hours after PDGF stimulation, and the increase became prominent at 48 hours. For type procollagen, an increase of mRNA expression was seen before the stimulation of PDGF, and the expression level was comparatively increased 48 hour

9、s later. The mRNA expression of PDGF was increased by 2-3 times 6 hours after PDGF stimulation, and back to the original level 24 hours later. ConclusionsPDGF enabled to promote the proliferation of HSC and expression of collagens in HSC. The bi-phasic effect on the expression of collagens may be in

10、terrelated with the autocrine excretion of PDGF.Key wordsPlatelet-derived growth factor；Collagen;Gene expression regulation;Liver cirrhosis肝星状细胞(HSC)又名肝贮脂细胞或Ito细胞,在肝纤维化的发生发展中起重要作用。肝损伤因子引起的肝细胞损害可刺激Kupffer细胞释放血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)等多种细胞因子，激活肝星状细胞增生、转化为肌成纤维细胞样肝星状细胞，合成、分泌大量细胞外基质，参与肝纤维化的发生。PDGF是机体最重要

11、的促细胞分裂因子，其在动脉粥样硬化、骨髓纤维化、系统硬化症以及肺纤维化中的作用多有报道1，虽然体外细胞培养业已观察到PDGF有较强的刺激肝星状细胞增殖作用2，但其实验使用的是低浓度血清培养基，无法排除血清中其他细胞因子的作用，故我们采用无血清培养基对PDGF的促肝星状细胞增殖作用做进一步观察；同时检测PDGF对肝星状细胞的、型前胶原和PDGF-B等基因表达的影响。以进一步证实PDGF在肝纤维化发生中的作用。材料与方法1大鼠肝星状细胞的分离和培养：依袁桃霞等3方法分离大鼠（SD种,体重400 g左右,本院动物部提供）肝星状细胞，以105/ml细胞数接种于48孔培养板或培养瓶，细胞生长于含20小牛

12、血清、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 g/ml)、10 mmol/L Hepes的DMEM培养基(pH 7.0)中，37恒温, 5 CO2培养(Heraeus培养箱)。48 h换液，去除未贴壁细胞，以后每72 h换液。2细胞增殖的检测：生长于48孔培养板的肝星状细胞培养5 d后,换QBSF56无血清培养基（Sigma产品）培养2 d，然后分别加入下列剂量的细胞因子：PDGF-BB（Oncogene公司)、EGF（Sigma公司）、TGF-1（R D Systems公司）各0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 ng/ml。每一剂量重复3孔，同时加入3H-TdR 37 kBq/孔

13、。24 h后中止反应，细胞转移至F49滤纸，液闪仪(Beckman公司)计数cpm。3肝星状细胞的PDGF处理及总RNA抽提：接种于培养瓶的肝星状细胞经DMEM(含20%小牛血清)培养5 d后，换QBSF56无血清培养基培养2 d，然后添加PDGF-BB 5 ng/ml，分别作用6、12、24和48 h，之后以108细胞经原位变性溶解细胞抽提总RNA。经RNA定量后，各样品取10 g总RNA行甲醛变性凝胶电泳，并行Northern印迹后转移至尼龙膜。4.肝星状细胞、型前胶原及PDGF-B的mRNA表达的检测：大鼠1 ()和人1()cDNA（由美国康涅狄格大学David Rowe教授惠赠）及人P

14、DGF-B cDNA（美国密苏里州血液科肿瘤研究所Lee Rataer教授惠赠）片段长度分别为1.3、0.7和0.45 kb,重组质粒转化冻存菌液经LB培养基扩增后，以碱变性法抽提质粒DNA，经限制性酶消化后，用透析袋洗脱回收各探针。随机引物法(Amersham公司)标记32P后与肝星状细胞Northern印迹尼龙膜杂交24 h。X光片-70曝光10 d后显影。另取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)-cDNA探针与尼龙膜杂交作为内参。结果1.PDGF对肝星状细胞增殖的影响：经无血清培养基培养的大鼠肝星状细胞经不同浓度的PDGF、EGF和TGF-1作用24 h，3H-TdR标记法观察。结果表明

15、，PDGF和EGF均可促进肝星状细胞的DNA合成，有明显的促肝星状细胞增殖的作用，其作用在0.510 ng/ml之间呈剂量依赖性增强，剂量大于10 ng/ml时,促DNA合成的作用达到饱和。PDGF和EGF相比,前者的促肝星状细胞增殖的效应更为明显。而TGF-1则没有促进肝星状细胞的3H-TdR掺入的作用(1)。1PDGF-BB、EGF、TGF-1对肝星状细胞3H-TdR掺入的影响2.PDGF对肝星状细胞的、型前胶原mRNA水平的影响：体外培养肝星状细胞给予PDGF刺激12 h ，见型前胶原mRNA表达已有增强，随后下降，至48 h 型前胶原mRNA表达显著增强；型前胶原mRNA水平在添加PD

16、GF 12 h即见表达增强，随后下降，48 h再度低水平增强(2)。3.体外培养大鼠肝星状细胞可表达PDGF-B mRNA，在给予PDGF-BB刺激后6 h，可见PDGF-B mRNA表达增加23倍，至24 h恢复到刺激前水平(2)。讨论在病理条件下肝星状细胞被激活、分化，大量增生并分泌细胞外基质，从而成为肝纤维化发生发展的主要参与者。肝星状细胞的激活、增生被认为主要是受Kupffer细胞释放的多种细胞生长因子所调节，Kupffer细胞的培养上清可促进肝星状细胞的增殖，但这种作用可被抗PDGF抗体阻断相当一部分，显示了PDGF在促进肝星状细胞增殖上的重要作用4。PDGF是机体重要的促分裂因子，

17、有A、B两条肽链，通过二硫链连接形成，可有AA,BB,AB 3种结合形式，它通过与靶细胞上的受体结合而发挥其生物学效应。PDGF受体也有、两型, 型受体与A链或B链结合, 而型受体则只能与B链结合。研究证明, 大鼠肝星状细胞只有型受体，只能于PDGF-B链结合5。Pinzani等2曾报道了PDGF对肝星状细胞增殖的刺激作用，但其实验中使用的是低浓度血清培养基，这样在添加PDGF等细胞因子时就没有完全去除其他细胞因子的影响，其结果为以PDGF为主的综合效应。本实验中肝星状细胞采用了严格的无血清培养，结果PDGF-BB仍显示了较强的促肝星状细胞增殖作用，其10 ng/ml的PDGF-BB对肝星状细

18、胞的增殖刺激作用比同浓度的另一生长因子EGF强一倍，进一步证实了PDGF对肝星状细胞的促增殖作用。2PDGF对肝星状细胞、型前胶原及PDGF-B的mRNA表达水平的影响自从80年代初人们成功分离大鼠肝星状细胞开始，利用肝星状细胞体外培养技术探讨其胶原合成作用的研究取得不断进展，研究结果表明，体外培养的肝星状细胞可产生、和型胶原，所以被认为是肝脏主要的胶原合成细胞；已有报道,一些细胞因子如TGF-能促进肝星状细胞胶原合成6。由于PDGF对肝星状细胞具有较强的促增殖作用，所以也间接促进了胶原的生成，至于PDGF能否直接促进前胶原基因的表达而增加肝星状细胞胶原的合成还需实验证实。本实验结果显示，PD

19、GF可直接引起体外培养肝星状细胞、型前胶原mRNA的表达水平增加，说明其对胶原的合成也有促进作用。人们早就观察到了细胞增殖与胶原合成的相伴现象，例如乳腺上皮细胞增殖时的型胶原合成7以及原代培养肝细胞增殖时的、型胶原的合成8，但机理尚不明确。PDGF作为机体重要的促分裂因子，它所引起的肝星状细胞增殖是否与、型胶原基因的表达相关，也就是说细胞的生长反应基因(growth response gene)与前胶原基因的表达有否内在联系，这还需要细胞生物学和分子生物学的深入研究。至于PDGF引起肝星状细胞、型前胶原mRNA水平的时相变化，其机理尚不十分清楚，可能与下列因素有关：（1）mRNA对基因表达的负

20、反馈作用所致，即、型前胶原mRNA的第一次升高对基因的表达产生了抑制作用，前胶原mRNA的表达随之下降，继而对基因表达的抑制作用减弱，使前胶原mRNA的表达再度增强。（2）肝星状细胞PDGF的自分泌作用所致，前胶原mRNA表达的第一次升高是外源性PDGF引起，而第二次升高则是由肝星状细胞内源性的(自分泌的)PDGF引发。（3）PDGF诱导肝星状细胞其他细胞因子自分泌的作用所致，例如引起TGF-的自分泌，刺激胶原基因表达增强，出现前胶原mRNA水平的第二次上升。从本文的实验结果看,第二种机理的可能性较大。以上结果提示PDGF在肝星状细胞参与肝纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。（本文编辑：齐文安

21、霍临明）基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670287，39330140)通信作者：张锦生作者单位：刘学松（上海医科大学病理学教研室200032）张锦生（上海医科大学病理学教研室200032）张月娥（上海医科大学病理学教研室200032）参考文献：1冉丕鑫. 血小板生长因子研究进展. 国外医学生理、病理科学与临床分册,1993,13:136.2Pinzani M,Gesualdo L,Sabbah GM, et al. Effects of platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA synth

22、esis and growth of cultured rat liver fat-storing cells. J Clin Invest,1989,84:1786-1793.3袁桃霞,张锦生,张月娥,等.大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报,1996,23:90.4Friedman SL,Arthur MJ. Activation of cultured rat hepatic lipocytes by Kupffer cell conditioned medium. Direct enhancement of matrix synthesis and stimulation of cell proliferation via induction of platelet-derived growth factor receptors. J Cli