调心方中β淀粉样蛋白结合成分的初步探讨

1、调心方中淀粉样蛋白结合成分的初步探讨                    作者：程敏, 冯琼, 钱淑文, 高慧, 朱粹青【关键词】  淀粉样蛋白; 调心方; 乳酸脱氢酶; 老年性痴呆   Objective: To explore whether there are -amyloid protein (A) binding elements in heart-beneficial re

2、cipe (HBR, a compound traditional Chinese herbal medicine), which can ameliorate the cytotoxicity of A.   Methods: The extract of HBR and A1-40 were co-precipitated, and the A1-40 in pellets was detected by immunoblotting. Affi-gel-A1-40 was constructed, and Affi-gel-A1-40 affinity element

3、s from the extract of HBR were analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC). The assay of lactic dehydrogenase (LDH) release from the primary cultured rat cortex neurons was used to evaluate the cytotoxicity of A1-42, and the protection effects of the HBR serum and the Affi-gel-A1-40 tr

4、eated HBR serum.   Results: Immunoblotting examination showed A1-40 could be co-precipitated with components of HBR following co-incubation, and the amount of A1-40 within pellets decreased when the HBR extract was diluted. A1-40 affinity elements from the extract of HBR, eluted from Affi-

5、gel-A1-40 by glycine solution (pH=2.5), could be detected by HPLC-fluorescent detector system. The analysis of LDH release showed that exposure of neurons to 5 mol/L A1-42 for 48 h caused a significant increase of LDH release in either a serum free or 10% serum contained culture condition (P0.01). T

6、he rat HBR serum was able to suppress A1-42 induced LDH release (P0.05), whereas Affi-gel-A1-40 treated HBR serum still maintained the ability to attenuate A1-42 induced LDH release although the effect was somewhat decreased compared with Affi-gel treated HBR serum.   Conclusion: There are

7、 A affinity components in HBR, which could not increase the A cytotoxicity, but might be able to inhibit the cytotoxicity of A. The results implied that the exploration of A affinity elements from Chinese medicinal recipe which is effective for Alzheimer disease, might be an important direction in A

8、lzheimer disease therapeutic research area.   Keywords: -amyloid protein; heart-beneficial recipe; lactic dehydrogenase; Alzheimer disease   老年性痴呆（A1zheimer disease, AD）是一种与增龄相关的神经系统退行性疾病。随着社会人口的老龄化，其发病率呈上升趋势。淀粉样蛋白（-amyloid protein, A）不仅是AD脑病理结构之一，即老年斑的主要组分，而且A所介导的神经毒性在AD脑病理改变中起非

9、常重要的作用，它可激活胶质细胞分泌多种细胞因子，诱导与神经纤维缠结相关的tau蛋白磷酸化，诱导神经元凋亡等1。因此，目前抗A的神经毒性作用已成为防治AD研究的重要方向之一2。调心方的临床研究提示其有改善AD痴呆症状的作用3，4，而实验研究已经显示其可减少A诱导的神经毒性5-7。本实验试图探索调心方中是否有直接与A作用并抑制A神经毒性的成分。   1  材料与方法   1.1  调心方提取物A结合分析   1.2  调心方抑制A对原代培养神经元的毒性作用   1.3  统计学方

10、法  数据用Excel 2000的Students t检验进行各组间分析。P0.05认为差异有统计学意义。   2  结  果   2.1  调心方共沉淀A1-40  调心方提取液中加入A，相互作用后，在离心沉淀中可检出A。随调心方的稀释，沉淀减少；同样，随调心方的稀释，可见沉淀的A量也减少。另外还可见调心方沉淀中A的电泳迁移并没有明显的改变。见图1。   2.2  HPLC检测Affi-gel-A1-40吸附的调心方成分  被Affi-gel-A1-40吸附的调心

11、方成分，如果不经OPA柱前衍生处理，本实验的HPLC分离检测系统则无法检测到阳性信号，见图2A；而经柱前衍生可检测到一些阳性信号，第1、3峰为特异峰，见图2B和D；图2C和E中的2号峰为洗脱液中的甘氨酸峰，而4号峰由于在对照Affi-gel吸附成分中也能被检测到，因此认为是非特异峰。   2.3  Affi-gel-A1-40吸附处理的调心方药物血清对A1-42诱导的神经元损害的影响  实验观察了较低浓度的A1-42对原代培养神经元的损伤作用。结果显示，1 mol/L和5 mol/L A1-42在无血清环境中处理48 h后均可导致明显神经元损害，LDH漏

12、出率分别为（124.9±21.3）%，n=6和（148.7±19.7）%，n=6，较溶剂假损伤对照（100.0±10.7）%，n=6显着增加（分别为P0.05和P0.01）。同样在含10%正常大鼠血清的系统中，5 mol/L A1-42处理48 h后LDH漏出率（134.4±13.9）%，n=6也较溶剂假损伤对照（100.0±9.1）%，n=6明显增加（P0.01）；而10%调心方大鼠血清可显着减少A1-42诱导的LDH漏出率（110.6±14.2）%，n=6），差异有统计学意义（P0.05）。经Affi-gel-A吸附处理的调心方药

13、物血清能显着减少A1-42诱导的LDH漏出率（118.2±10.4）%，n=6；P0.05；用作为对照的Affi-gel吸附处理的调心方药物血清亦能显着减少A1-42诱导的LDH漏出率（107.9±11.8）%，n=6；P0.01）。经Affi-gel-A吸附处理的药物血清的效果较Affi-gel吸附处理药物血清效果有所下降，但两者之间的差异无统计学意义。见图3。   3  讨  论   目前对AD的治疗是研究热点之一，研究发现许多中药制剂可改善AD的学习记忆能力，如调心方和脑还丹等3，4，9。调心方以党参补心气、

14、安神明；以远志、石菖蒲、茯苓化痰浊、通心窍，用之于临床，的确能有效改善AD患者认知功能和生活能力3，4。以往的实验研究主要集中在明确调心方抗A对神经系统损害的效果以及调心方调节神经元凋亡相关基因表达5，7。但调心方中的某药物成分是否有可能通过直接与A作用而抑制A毒性，目前尚未见报道。            本实验用的是新鲜配置的A，一般认为是单体型。实验显示，随提取液的稀释，A与调心方共沉淀也明显减少；提示A单体沉淀与调心方提取液中的成分有关，而不是A的非特异沉降。沉淀中的A电泳迁移没有明显变慢

15、，提示与A结合的成分在变性条件下可游离下来。为进一步验证调心方中有A结合成分，利用HPLC分析系统对此进行了分析，结果同样提示调心方中有与A结合的物质存在，但尚不知道这些是什么物质。根据本实验室HPLC分析系统检测的是小分子物质的原理，提示调心方中存在与A结合的小分子物质；由于实验条件限制，不能排除调心方中有未能检测到的能与A结合的大分子存在。另外，由于这种方法需要样品的柱前衍生，其原理是基于OPA与巯基试剂在碱性条件下与伯胺类反应产生异吲哚衍生物，因此我们推测本实验HPLC检测观察到的A结合组分为含伯胺基团的小分子；同样，如果有能与A结合而不含伯胺基团的物质，这种方法也检测不到。 

16、  能与A结合的物质并不一定对抗A神经毒性，有些结合物可能反而促进A的神经毒性，例如ApoE4 10。为了解调心方中与A结合的成分对A神经毒性的影响，我们用小剂量（1 mol/L和5 mol/L）单体A1-42对原代培养神经元作用48 h的模型进行了观察，这种模型可能涉及A在培养体系中对细胞本身A代谢的影响以及A在培养体系中的聚集11。结果显示调心方药物血清在Affi-gel-A1-40吸附处理后，其抗A1-42毒性作用有下降趋势，但仍有效。提示调心方中的A结合成分可能不会促进A1-42的毒性；同时也反映调心方药物血清中除有A结合成分外，可能还有其他调节神经元抗损伤的成分。以后的研究

17、还需要进一步处理药物血清中干扰观察指标的成分，因为正常血清成分中也含有A结合成分，如甲状腺激素结合蛋白（transthyretin）12。   给予外源性A结合物质来抑制A的神经毒性是目前治疗AD研究中的一个重要领域 2, 10。例如，原本用于老年斑检测的刚果红也被用于抗A神经毒性的研究2，而刚果红其实也是从植物中提取的物质。从对AD有效的中药方剂中提取、鉴定A结合物质，研究它们的神经保护作用，将是一个值得关注的研究方向。【参考文献】  1 Selkoe DJ. Alzheimers disease: a central role for amyloid. J N

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22、ase. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2006; 26(2): 147-151. Chinese with abstract in English.杨戈, 林水淼, 赵伟康, 等. 调心方有效部位对类AD大鼠脑组织凋亡信号转导分子Caspase-3及凋亡相关基因bcl-2,bax mRNA表达的影响. 中国中西医结合杂志. 2006; 26(2): 147-151.7 Yao MZ, Zhao WK. Effect of Tiaoxin Recipe on -amyloid induced neurotoxic model of the primar

23、y cultured rat hippocampal neurons. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2001; 21(9): 674-676. Chinese with abstract in English.姚明忠, 赵伟康. 调心方对淀粉样蛋白所致原代培养海马神经元细胞毒模型的影响. 中国中西医结合杂志. 2001; 21(9): 674-676.8 Schgger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD. Anal Biochem. 1987; 166(2): 368-379.9 Li QM, Meng RS, Wei CX, et al. Effects of Naohuandan Recipe on learning