转基因防龋生菜叶片转化体系的优化.docx

1、转基因防齿禹生菜叶片转化体系的优化陈筑瑚，刘建国'，张燕）马欣荣3,吴家媛'，唐琳二管晓燕'，顾瑜'，白国辉'（1.遵义医学院附属口腔医院，贵州遵义563000；2.贵阳市口腔医院，贵州贵阳550002；3.中国科学院成都分院生物研究所，四川成都610041）摘要：目的：优化生菜的基因转化系统，为下一步防胡用转基因植物表达载体质粒转化生菜工作提供实验基础。方法：以6种不同的生菜种子为试材，以1/2MS为基础培养基，经对出芽率比较，苗龄及直接分化培养基的确定以及抗生素敏感性测试，获得正常再生抗性生菜植株。结果：34d的“意大利”生菜子叶在1/2MS+0.0

2、5mg/LNAA+0.Img/L6-BA培养基上直接分化率最高，生根培养其为1/2MS,抗生索巴龙霉素（Pan）momycin）选择压浓度为50mg/Lo结论：成功确立了防格用转基因植物表达栽体质粒的生菜叶片转化体系，获得了较高的转化频率。关键词：生菜；叶片；植株再生；融病中图分类号：S636.2文献标志码：A文章编号：1001-4705（2012）0830054）5TheOptimalConditionsofTransgeneticSystemofLettuceAgainstDentalCariesCHENZhu'2,LIUJian-guo*,ZHANGYan',MAXin-

3、rong3,WUJia-yan1,TANGLing*,GUANXiao-yan1,GUYu1,BAIGuo-hui1(1.TheAffiliatedStomatologicalHospital,ZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000,China；2.TheStomatologicalHospitalofGuiyang,GuiyangGuizhou550002,China；3.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,ChengduSichuan610041,Cihna)Abstract:Objec

4、tive:Toobtainoptimalconditionsoflettucetransgeneticsystem,whichcouldprovidetheconditionforthefurthertransformationstudyoftransgenicplantexpressionvectoragainstdentalcaries.Method:Byusingthesixdifferentvarietieslettuceasexplants,thetechnologyofplantregenerationwasstudied.Severalfactorssuchasbudratio,

5、hormoneconcentrationandtheantibioticselectionpressureandsoon,wereinvestigatedtooptimizetheregenerationsysteminvitro.Result:Theexperimentalresultsshowedthatcomparedwithsixdifferentvarietiesoflettuce,Theseedof"YiDali"lettucesproutfastestanditsbudratioisthehighest.Itisshownthatthebestoptimalc

6、onditionsisthatthe3-4dayoldlettuceplantcotyledongrewonthe1/2MS+0.05mg/LNAA+0.1mg/L6-BAmedium；Itwasoptionaltochoice50mg/Lparomomycinastheantibioticselectionpressure.Conclusion:Theconditionsoflettucetransgeneticsystem,whichshouldprovidetotransformationoftransgenicplantexpressionvectoragainstdentalcari

7、es,weresuccessfullyconstructed.Keywords：lettuce；leaf；plantregeneration；dentalcaries收稿日期:2012-05-19项目基金：国家自然科学基金资助项目（编号：30160086）；教育部高等学校特色专业建设项目资助（文件号:教高函：200731号）；贵州省高等学校示范性专业建设项目资助（文件号：黔教高发2008J184号）；贵州省高层次人才科研条件特助经费项目（合同号:TZJF-20I1年-30号）。作者简介:陈筑（1979-）,女，贵州省贵阳市人;博士，主治医师，研究方向：胡病的免疫学防治;E-mail：16058

8、94600。通讯作者：刘建国，博土，教授，主任医师;E-mail转基因植物可食疫苗具有生产成本低、可永久表达外源蛋白质、不用冷藏、町直接食用等优点，有关转基因植物可食疫苗的研究受到高度的重视，该领域的研究进展非常迅速。植物转基因的前提条件是建立高效的植株再生系统。生菜极富营养，含有抗氧化物、F胡萝卜素及维生素B,工2工6、维生索C和维生素E,它还含有丰富的微景元素和膳食纤维素。最新的研究发现，球形生菜中含有一种原儿茶酸物质，对胰腺癌有明显的抑制作用。另外，常吃生菜能改善胃肠血液循环、有效预防胆石症和胆囊炎等功效。牛.菜吃法甚多，深受大众喜爱。转基因植物工程中,生菜遗传

9、转化研究开展较早，有较好的遗传转化体系，已成为不错的生产食用疫苗生物反应器1材料与方法11材料1.1.1生莱材料实验用生菜为美国大速生、意大利生菜、路路通、意大利抗热耐抽墨生菜、香港玻璃生菜、台湾玻璃生菜，购至四川省农科院种子公司。分别命名为S1、S2、S3、S4、S5和S6。1.1.2质粒和菌株转化用农杆菌为EHA105,分别含植物表达载体质粒p2355-gtfB（携带选择标记基因为抗性基因npt-D基因及报告基因gus）和p2365-gtfB（携带选择标记基因为抗性基因npt-D基因）（本课题组前期构建）。12方法1.2.1不同生菜种子出苗率比较生菜种子（S1、S2、S3、S4、S5和S6

10、）用3%4%次氯酸钠水溶液振荡灭菌15min后，以无菌水清洗3次，播种于1/2MS培养基上，每个三角瓶15粒，光照16h/d,25X.条件F诱导发芽。14d后统计各生菜种子的出苗率，选择发苗率最高的一种生菜苗进行下一步实验。1.2.2苗龄及直接分化培养基的确定取苗龄为34d、710d的生菜子叶横向切片去除端部，每叶24片，置于FlF8培养基E,每皿10个。25丁，16h/d光周期条件下诱导不定芽形成。1个月后统计不定芽发生的外植体频率。1.2.3 抗生素敏感性测试根据离体培养结果，筛选出适宜的选择再生培养基F1及34dS2生菜子叶，用F1附加抗生素进行抗生素敏感性测试。将S2外植体置于附加（0

11、、10、15、25、5O、75、1OOmg/L）的卡那霉素F1培养基上。另取一部分子叶接种于附加（。、25、50.75mg/L）的巴龙霉素F1培养基上，分别进行卡那霉素、巴龙霉素的敏感性测定，培养条件同上，定期记录分化情况。1.2.4 菌株培养将-70勾保存的含有植物表达载体的根癌农杆菌阳种EHA105接种于3mL含Km（100陌mL）和利福平（100妃mL）的I.B液体培养基中,28X.200r/min振荡培养过夜，使0D处值为0.60.8。按1%2%的比例转入新配制的无抗生素的1/2MS液体培养基中，同时加入100mol/L的AS。在与上相同的培舞条件卜培养6h左右,01）如值约为0.5时

12、即可。1.2.5转化及筛选于无菌操作台将34d苗龄的生菜子叶,放入浸染液中浸染15min后取出，叶背向下置于共培养基中,25Y暗光培养2d后,将切片转入分化培养基中，25Y培养，每皿10个外植体,14d继代1次。1.2.6生根及移载将长出的不定芽转入加巴龙霉素50mg/L,特美汀100mg/L的1/2MS培养基中诱导生根。生根后开瓶锻炼，移入土中。2结果2.1生菜发芽率的比较实验比较（S1、S2、S3、S4、S5和S6）6种生菜材料,意大利生菜（S2）种子在1/2MS培养基上发芽最快、出芽率最高,差异有统汁学意义（p<0.05）（见表1）。表1生菜发芽率的比较品种编号成熟种子出芽数出芽（

13、%）美国大速生S11005353意大利生菜S21008383路路通S31007070意大利抗热耐抽苔生菜S41005757否港玻璃生菜S51006565台湾玻璃生菜S6100676710.0500.1347-105050增长再生最好增K再生较好403020.050.23-450大部分褐化177-1050无再生芽030.100.13450大部分祸化)97-1050大部分福化340.!0.23450无再生芽071050无再生芽0500.50.053-450无再生芽071050无再生芽060.50.13-450无何生芽071050无再生芽0701.00.053-450生长缓慢2571050无再生芽0

14、81.00.13450生长缓慢1771050无再生芽010.0500.1347-105050增长再生最好增K再生较好403020.050.23-450大部分褐化177-1050无再生芽030.100.13450大部分祸化)97-1050大部分福化340.!0.23450无再生芽071050无再生芽0500.50.053-450无再生芽071050无再生芽060.50.13-450无何生芽071050无再生芽0701.00.053-450生长缓慢2571050无再生芽081.00.13450生长缓慢1771050无再生芽0激素水苗龄外植体数应止牯冷直接分化率NAAIAA6-BA（d）（个）珈（%

15、）不同激素浓度对不同苗龄生菜叶片外植体芽分化的影响2.2苗龄及直接分化培养基的确定在1/2MS培葬基中加入不同的激素.配制成多种培养基，对苗龄为34d、710d的生菜子叶叶片进行研究，筛选分化效果好的培养基。不同浓度组合对生菜再生影响结果见表2。S2生菜子叶接种57d后，各培养基中绝大部分生菜子叶边缘或基端切口处开始有愈伤产生JOd左右，在部分培养基中愈伤组织大代增生，部分培养基中愈伤组织不继续再生而分化出绿芽,通过对不同苗龄的生菜在儿种不同培养基中分化情况的统计，发现34d的S2生菜子叶在F1培芥基中培养710d后,部分子叶从切口直接形成绿色小芽,宜接分化率为40%。其余培养基直接分化率较低

16、，且外植体在7d后容易出现褐化死亡。2.3抗生素敏感性洲试生菜在对卡那毒素及巴龙得素的敏感性魂I定中发现,在使用Km时生菜白化苗现象较高，而用巴龙霉素没有发现白化茴.确定选择50mg/L巴龙霉素作为抗生素进行转基因生菜的筛选。2.3.1卡那霉素敏感性测定表3Km敏感性实验Km浓度（mj/L）01015255075100外植体数(块)50505050505050代接分化率(%)401062000生根及植株情况好较好少数出现白化苗生长缓慢无无无A：4dA右生菜外植体在分化培养米上周围少量愈伤生成;B：714d生菜外植体愈伤姐炽芽分化;C：4抗径生菜在生根培养房中长根；D：检证携0的获因的转基因生菜

17、移枝至土坟中栽培图1生菜转化将苗龄为34d的生菜子叶置于附加不同浓度Km的F1培养基上，可见Km为0时愈伤组织正常产生并分化或直接从切口处出芽、生根，植株正常生长;附加Km后所有培养的子叶均无愈伤组织产生，含10、15.25mg/LKm的培养基中少数子叶产生生长缓慢并逐渐白化的小芽或直接产生白化芽、芽分化及根生长率明显降低。子叶及植株在含50mg/L以上的Km分化培养基中黄化逐渐死亡。统计结果分析显示，50mg/LKm作为选择压力较好(见表3)。2.3.2巴龙霉素敏感性测定将34d的生菜子叶置于附加不同浓度巴龙篝素的F1培养基上，可见巴龙霉素为0时愈伤组织正常产生并分化或直接从切口处出芽，生根

18、及植株并正常生长;附加巴龙霉素后所有培养的子叶均无愈伤组织产生，含10、15、25mg/L巴龙霉素的培养基中，芽分化及根生长率明显降低。子叶及植株在含50mg/L以上的巴龙霉素分化培养基中黄化逐渐死亡。50mg/L巴龙霉素作为选择压力较好(见表4)°表4巴龙霉素敏感性实验巴龙浓度(mg/L)01015255075100外植体数(块)50505050505050真接分化率(%)401351000生根及植株情况好较好缓慢生长缓慢生长无无无2.4转基因生菜抗性植株的获得通过农杆菌介导的叶盘法分别将植物表达质粒p2355-gtfB、p2365-gtfB转化生菜。浸染的生菜子叶叶盘在诱芽筛选培

19、养基(MS+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+50mg/L巴龙+100mg/LTim)培养14d左右即可诱导出芽,将长至11.5cm的芽切下，插入1/2MS+50mg/L巴龙+100mg/LTim的生根培养基诱导生根，生根者为抗性植株，转移至土壤种植。本实验共得到抗性生菜129株,携带表达质粒P2355-gtfB75株,携带表达质粒p2365-gtffi64株，经观察携带P2365-gtfB的生菜植株普遍比携带p2355-gtfB健壮(见图1)。3讨论3.1植物受体的选择目前,转基因植物疫苗的研究报道主要集中在烟草、马铃薯、拟南芥等模式植物上，如在烟草中表达链球圜属突变株表面蛋白

20、、乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏肠毒素B亚基表面蛋白、人类细胞巨化病毒表面蛋白，在马铃薯中表达霍乱病毒表面蛋白、诺沃克病毒表面蛋白和细菌性腹泻抗原，以及用拟南芥生产口蹄疫抗原等，但这些植物都不适合生产可食用的口服疫苗。生菜为菊科茵苣届植物,是一种由国外引进的生食蔬菜,具有较高的营养价值，生长周期短，整株可以生食,再生和转化率较高，是一种用来表达外源蛋白的良好宿主植物。因此，本实验选用生菜作为转化受体植物，期望得到可生食的转基因生菜植株，为后续的动物实验和一系列免疫实验研究提供依据C3.2生菜的高频率再生系统3.2.1 外植体的选择外植体的选择是建立再生系统的第一环节。作为转基因植物外植体材料已经研

21、究得非常广泛，涉及到植物的各个组织、器官和部位，不同外植体的脱分化和再生能力、细胞全能性潜在趋势及感受态程度等都有很大差异。本实验通过对不同生菜子叶为外植体建立离体培养再生系统的过程中发现，不同品种的生菜外植体之间的分化能力差别很大，在6个品种中，意大利生菜子叶具有增殖及再生能力强,且稳定性好的特点。已有学者报道，以生菜子叶为外植体的成功转化能诱导宿主产生相应的抗体SE。本实验通过对34d、710d的意大利生菜子叶的直接分化率比较发现，34d的生菜子叶获得的不定芽明显高于710d的生菜子叶。3.2.2 直接分化培养基的确定设计出适宜的培养基是建立好的再生系统的一项重要工作，也是进行基因转化研究

22、的先决条件。直接分化再生系统具有操作简单、方便、获得植株周期短、能较好保持植物稳定性、实现稳定遗传的优点。刘凡等研究表明，生菜大湖366以采用MS+(0.5mg/L)6-BA+0.1mg/LNAA的诱芽培养基为宜;赵吉强等对生菜的研究认为.MS+(0.1mg/L)6-BA+(0.05mg/L)NAA的诱芽培养基对芽的诱导率最高。而左晓峰质选用MS+(0.1mg/L)6-BA+(1.0mg/L)IAA诱导培养基获得了转基因生菜。本实验通过对NAAJAA分别与6-BA的不同激素的组合获得了芽的分化，得到了再生植株，结果表明，诱芽培养基以1/2MS+(0.1mg/L)6-BA+(0.05mg/L)N

23、AA获得的不定芽分化率最高。3.2.3抗生素的选择植物基因转化中最广泛应用的选择标记是新霉素磷酸转移酶基因(nptU)，它编码的产物对某些氨基葡糖昔类抗生素如抗巴龙霉素、G418、新霉素、卡那霉素等反应敏感。如果抗生素对植物细胞毒性太大，在短期内很快杀死植物细胞，造成转化细胞难以存活，因此选择既能有效地抑制非转化细胞的生长，又不影响转化细胞正常生长的抗生索及其浓度至关重要。本实验早期我们选用卡那霉素作为选择剂，发现选择压力在50mg/LKm时不定芽在生长过程中逐渐变为白化苗,没能获得转基因苗。后来改用浓度为50mg/L的巴龙霉素筛选,获得的抗性植株经验证大多数为含目的基因的转基因材料，效果极佳

24、。3.3关于选择标记基因对转基因植株的影响在基因转化过程中，当筛选到转基因植株后，标记基因的存在不仅影响目的基因的稳定，而LL会加重植物细胞代谢的负担。此外，标记基因的安全性问题也是值得考虑的问题：“皿，所以去除标记基因有利于外源基因的稳定表达。本实验构建了携带。-葡萄糖昔酸酶基因(gusA)的植物表达质粒p2355-gtfB和在其基础上去掉gusA基因的植物表达质粒P2365-gtlB,通过对转基因生菜的观察发现不含gusA基因的转基因生菜普遍生长较含gusA基因的转基因生菜健壮，旦部分GUS染色阴性的生菜植株也能扩增出gtfB部分目的片段，提示标记基因的存在可能对转基因生菜的生长及表达特性

25、有影响，标记基因对转基因生菜中GTF-1的表达及对转基因生菜的遗传稳定性和安全性的影响有待进一步研究。参考文献：1GiddingsG,AllisonG,BrooksD,etal.TransgenicplantsasfactoriesforbiopharmacculicalsJ.NatBiotechnol,2000,18(11):1151-1155.i2KanagarajAndersonPaul,VermaDheeraj,DaniellHenry.Expressionofdengue-3premembraneandenvelopepolyproteininlettucechloroplasts.

26、PLANTMOLECULABBIOIXJGY,2011,76(3-5):323-333.3MarcondesJackson,HansenEkkehard.TransgeniclettuceSeedlingsCarrjingHepatitisBVirusAntigenHbsAg.BRA-(上接第4页)参考文献：1李立会,李秀全.杨欣明.小麦种质资源描述规范和数据标准M.北京：中国农业出版社,2000：50-60.2矣金华，吉万全,李凤珍.黑麦在小麦改良中的应用研究进展.麦类作物学报2005,25(1):115-119.；3YangZJ,LiGR,JiangHK,ergenomic

27、interactionofNucleolus,gliadinanddiseaseresistanceinaTriticurnAcsli-vuni-SccaleAfricanumamphiploidfJ.JournalofSichuanAgri-cuhureCniversity,2(X)1,19(4)：34O-343.'4KorzunV,Malyshev8,VoylokovAV,etal.Ageneticmapofrye(SecalecerealeL.combiningRELP,isozyme,protein,mic-njsatelliteandgeneloci：J!,ITieorApp

28、iGenet,2001(102):709-717.5物向晖，吴颖欣，林顺权.6种枇杷属植物花粉形态扫描电镜观察J.果树学报.2009.26(4):572-576.ZILIANJOURNALOFINFECTIOUSDISEASES,2008,12(6)：469-471.k4HuyNguyen-Xuan,KimYoungSook.JunSang-Chel,etal.ProductionofaHeat-labileEnterotoxinBSubunit-porcineEpidemicDiarrheaVirus-neutralizingEpitopeFusionProteininTransgenicLettuce(Laclucasativa).BIOTECHNOLOGYANDBIOPROCESSENGINEERING,2009,24(6)：731-737.5唐琳，刘建国，马欣荣.两种灭菌方法对番茄种子灭菌效果的评价J.种子,2008；27(9)：17-186PniewskiTomasz,KapustaJozef,BociagPiolr,etal.Low-doseoralimmunizationwithlyophilizedtissueofherbicide-resistantlettuceexpressinghepatitisBsurfaceantigenforpro