微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色

1、.一、实验目的一、实验目的1 1、学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原、学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原理及步骤。理及步骤。 2 2、学习微生物涂片、染色技术和无菌操作。、学习微生物涂片、染色技术和无菌操作。3 3、巩固显微镜油镜的使用技术。、巩固显微镜油镜的使用技术。实验二 .二、实验原理二、实验原理1、细菌的简单染色原理、细菌的简单染色原理细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。在碱性、中性或弱酸性溶液中，细

2、菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料的染色部分带负电荷），因此，离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料的染色部分带负电荷），因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色。碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色。2、细菌革兰氏染色的原理、细菌革兰氏染色的原理G+菌和菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。G+菌菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透

3、性降低，结晶紫聚糖层的孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保留初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫色。保留初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫色。G-菌菌细胞壁的细胞壁的外膜层外膜层富含类脂富含类脂，而且其而且其肽聚糖肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时，层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙，使得细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫菌体内的结晶紫-碘复合物较易碘复合物较易渗出渗出，而使菌体变成无色而使菌体变成无色，再经番红再经番红复染复染就就成为红色。成为红色。.三、实验器材三、实验器材1 1、菌种：

4、、菌种：革兰氏染色：培养12 h16 h的枯草芽孢杆菌120和培养24 h的大肠杆菌。2 2、染色液和试剂：、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄或蕃红3 3、器材：、器材：载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。菌龄对革兰氏染色结果的影响：选取处于活跃生菌龄对革兰氏染色结果的影响：选取处于活跃生长期长期指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌体尚未成熟或菌体过老，可能使染色结果呈现相体尚未成熟或菌体过老，可能使染色结果呈现相反的结果。反的结果。.（一）简单染色的步骤（一）简单染色的步骤 （见见P11P11）1 1、涂片涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后

5、，横放于玻片架上；取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上； 在在载玻片中央滴载玻片中央滴一小滴一小滴生理盐水，生理盐水， 用接种环以无菌操作取少许用接种环以无菌操作取少许菌体菌体于水滴中于水滴中（注：不要挑破培养基注：不要挑破培养基）， 混匀并涂成薄膜混匀并涂成薄膜（注：涂片不易过厚注：涂片不易过厚）。2 2、干燥干燥：用夹子夹住载玻片一端（：用夹子夹住载玻片一端（菌膜面菌膜面朝上朝上），反复反复通过通过火焰火焰高处高处数次，数次， 烘干菌液（烘干菌液（注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形）。）。3 3、固定固定：用夹子夹住载玻片一端，迅速通过火焰用夹

6、子夹住载玻片一端，迅速通过火焰2 23 3次，次， 使菌体固定于载玻片上。使菌体固定于载玻片上。4 4、染色染色：将玻片平放于玻片架上，加适量（：将玻片平放于玻片架上，加适量（以盖满菌膜为度以盖满菌膜为度）染液于涂片上。）染液于涂片上。 染色时间染色时间1-2min1-2min。5 5、水洗水洗：倒去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗：倒去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗（切勿将菌膜冲掉）（切勿将菌膜冲掉）， 直至流下的水为无色为止。直至流下的水为无色为止。6 6、干燥干燥：将玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。：将玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残

7、留水分。7 7、镜检镜检：先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察：先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察 。四、实验步骤四、实验步骤.（二）革兰氏染色（二）革兰氏染色 （见见P12P12) )1、涂片、固定、涂片、固定（1）涂片涂片“三区三区”涂片法。涂片法。在载玻片的左端先加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量苏云金芽孢杆菌与左边水滴混合；将载玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。在载玻片的右端加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量大肠杆菌与右边水滴混合；将玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。（三区：左区苏云金芽孢杆菌区；中央区两种菌的混合区；右区大肠杆菌区）。（2）干燥及固定。干燥及固定。步骤同简单染色法。涂片

8、不易过厚，否则造成局部菌体脱色不完全，而使G-菌呈现革兰氏阳性结果。2、染色、染色（1）初染。）初染。将玻片置于玻片架上，加适量（以覆盖菌膜为度）结晶紫染液染色12 min；倾去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水为无色。（2）媒染。）媒染。加卢戈氏碘液一滴，染色1 min，水洗。（3）脱色。）脱色。将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（4）复染。）复染。滴加蕃红复染2min后，立即水洗至流出液无色。（5）干燥及镜检。）干燥及镜检。将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察 ，并判断菌体的革兰氏染色反应性。脱色时间对

9、革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，脱色时间对革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，G-菌转呈革兰氏阳性结果；菌转呈革兰氏阳性结果；如果脱色时间过长，如果脱色时间过长，G+菌转呈革兰氏阴性结果。菌转呈革兰氏阴性结果。媒染时间对革兰氏染色结果的影响：媒染时间过短，不利于结晶紫与细胞之间媒染时间对革兰氏染色结果的影响：媒染时间过短，不利于结晶紫与细胞之间的结合，而使的结合，而使G+菌转呈革兰氏阴性结果菌转呈革兰氏阴性结果;媒染时间过长，而使媒染时间过长，而使G-菌转呈革兰氏菌转呈革兰氏阳性结果。阳性结果。.结晶紫结晶紫碘碘 液液95%乙醇乙醇番番 红红初初 染染12min媒媒 染染1min脱色脱色2025s复复 染染2min.绘出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。（五）作业（五）作业 大肠杆菌（10100） 枯草芽孢杆菌120（10100）大肠杆菌大肠杆菌_ 色，革兰氏色，革兰氏_性菌；性菌；枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌120_ 色，革兰氏色，革兰氏_性菌性菌。（六）思考与讨论（六）思考与讨论1 1、造成革兰氏染色结果不正确（假阳性或假阴性）的主要原因有哪些？、造成革兰氏染色结果不正确（假阳性或假阴性）的主要原因有哪些？2 2、如果某一细菌的革兰氏染色