遗传性非息肉病性大肠癌基因研究进展

1、    遗传性非息肉病性大肠癌基因研究进展刘硕陆萍宫恩聪 大肠癌(colorectal cancer， CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上 升趋势。环境因素及遗传因素在其发病过程中起重要作用。遗传因素导致的大肠癌主 要有两种，其一是家族性大肠腺瘤息肉病(FAP)导致的大肠癌，约占CRC总数的1%； 其二是遗传性非息肉病性大肠癌综合征(herediary nonpolyposis colorectal cancer， HNPCC)， 约占CRC总数的15%18%，亦有报道占5%左右1，2。HNPCC是一种常染色体显性遗传 性疾病3，其发病特

2、点是：(1)早期发生大肠癌；(2)大肠以外多器官受累4。HNPC C缺乏明显的临床及病理学特点，给早期发现及诊断带来一定困难。Toshlaki Watanbe等 近来报道在HNPCC患者发现的73例息肉中，有37例平坦型腺瘤息肉，因而认为平坦型 腺瘤可能是部分HNPCC的癌前期病变5。 HNPCC的国际通用诊断标准(amsterdam criteria)是在一个家系连续2代的亲属中有 3名以上大肠癌患者，且至少有1名患者在发病时年龄小于50岁。在部分HNPCC家族 中，大肠以外的器官如子宫、卵巢、胃、肾等消化及泌尿生殖道也易发生恶性肿瘤6。 我们就HNPCC的研究状况、基因定位、基因结构、功能

3、、常见的基因突变方式、检测 基因突变常用方法及探索性治疗作一综述。 1 HNPCC的简单回顾 自从1895年Aldred Warthin's报道第1例家族性大肠癌至今有整整100多年的历史了6，8，9， 但Aldred Warthin's的报道在当时并未引起重视。直到1966年，又有人报道两个类似 家族，才又一次引起了人们的关注，并将其命名为癌家族综合征，不久又改称HNPCC6，10。 近年来，遗传易感性基因一直是遗传学家研究的热点。早在六、七年前，芬兰赫 尔辛基大学的著名遗传学家Albert de la chapelle教授及其合作者便开始了这项工作。他 们在发现FAP与遗传

4、易感性相关的同时，也发现一些没有息肉等明显特点的结肠癌患 者，同样具有遗传易感性，且占大肠癌发病总数的5%15%2，5，而FAP仅占1%。由 于同一家族的成员受饮食、环境因素的影响相似，这些非FAP患者的遗传易感性还显 得缺乏说服力。1989年，Vogel-stein和de la Chapelle决定合作研究这些家族是否存在遗 传易感性7。 2 HNPCC基因定位及功能探讨 协作组最初将工作重点放在确定来自癌家族的结肠或其它器官的癌瘤是否与p53、 DCC、APC等与结肠癌发生相关的基因有关。连锁分析表明这些基因与HNPCC的遗传易 感性无关。接着他们把焦点放在一个大家族上，结果又一无所获。恰

5、在这时，一个27岁 的癌家族成员患了结肠癌。患者年龄之轻，使他们又一次充满了信心。此时法国的 Jean Weissenbech研究组和James Weber等11研究出一组新的DNA标记，即微卫星DNA (microsatellite DNA)，它是大量随机分布于整个基因组中的串联重复序列，可作为常见 遗传病易感性基因定位的理想标记。Bert Volgelstein和Albert dela Chapelle等人研究了345 个微卫星标记后，发现在两个家族中HNPCC基因与D2S123均未见重组，提示其紧密连 锁。D2S123尚未确切定位，但研究发现其位于D2S5远端5cM，且D2S5已经原位杂

6、交、 连锁分析和体细胞杂交定位于2p15-16，因而将HNPCC基因之一定位于2p15-16,暂时命 名为FCC，后又改名为hMSH211，12。 此后,Nickolas Papadopoulos等在研究两个HNPCC家族时，发现这两家族与2p上的标 志无关，提示存在其它的HNPCC基因。于是他们用"已表达序列标志"(expressed sequence tag，EST)又鉴定3个与酵母mut L极其相似的基因。其中与mut L最相似的被 命名为hMLH1，另两个被分别命名为hPMS1和hPMS2。体细胞杂交将它们分别定位于3、 2、7号染色体上。由于位于3p21的标志先前

7、已发现与HNPCC相关，所以hMLH1引起人们 的极大兴趣，进而用基因组DNA与人类染色体进行荧光原位杂交，结合复染，将hMLH1 定位于3p21.3区段上13，14。 研究者们起初认为HNPCC基因与其它几个结肠癌相关基因如APC、p53一样，是经 典的肿瘤抑制基因。后者在肿瘤发生过程中至少要丢失两个拷贝的其中一个，但de la Chapella、Vogelstein研究组用2号染色体标志在家族成员的癌标本中并未鉴定出 缺失，而代之以2号染色体标志点的微卫星DNA长度的改变，进而他们在几乎所有分析 过的家族性肿瘤中均看到了类似的改变。以上工作表明，由于2号染色体上的基因改 变，导致结肠癌细胞

8、中的DNA在整体上没有被精确地复制。这一结果使他们想到了原 核生物的mutS及mutL基因。后二者是错配修复基因，其产物参与识别、校正错配碱基 对mutS和mut L的失活，导致了遍布整个基因组的微卫星序列的改变。经PCR扩增与克 隆分析，发现了人类具有与原核生物mutS、mutL的极其相似的同源序列，即hMSH2和 hMLH1，此二基因是人类的错配修复基因，负责人DNA复制的精确性。 3 hMSH2、hMLH1基因结构 为了确定定位于2p15上的hMSH2的基因序列，Fredrick S. Leach等用PNP-23的插 入片段筛选了用人类结肠癌细胞或胎儿脑组织构建的cDNA文库。用探针杂交

9、法及cDNA 步移法(cDNA Walk)共鉴定出147个cDNA克隆，经过对这些克隆的综合分析，得出了hMSH2 的cDNA序列，其开放的读码框架起始于cDNA5"末端下游的69nt处， 共有2 802bp。 起始这一开放的读码框架的蛋氨酸处于能进行有效翻译的适当位置，读框内具有一个 终止信号11。Stefan J用PCR法筛选了人P1基因库，分离出hMSH2的起动子区，并对 P1重组DNA直接测定，分析了hMSH2起动子1 100bp特点。起动子序列包含了许多蛋白结 合位点，但未发现常见的TATA和CAAT box，这种结构是多数管家基因起动子的典型结构。 如Bert Vogel

10、stein所说，hMSH2和hMLH1是所有管家基因的母基因15。hMLH1的cDNA 序列亦经类似的方法获得，其开放的读码框架开始于cDNA5"末端下游的第42位核苷酸， 共2 268个bp。读框内有适于有效翻译的起始蛋氨酸和终止信号，且hMLH1与mut L的读 码框架在全长范围内明显相似13。 4 hMSH2、hMLH1的常见突变方式 为证实hMSH2与HNPCC的关系，Leach等和Parsons等分别研究了2个和29个HNPCC家族， 并用正常个体作对照。结果发现了hMSH2的突变分散于5、7、8、12、13、15等外显子， 缺乏突变热点，但除了第12外显子在622密码子处

11、发生单个碱基突变外，其余多数突变均 是大片段的缺失16，17。Nickolas Papadopoulos等对10个与3P标记相关的HNPCC家族 的hMLH1基因进行研究，确定了hMLH1的常见突变方式与hMSH2相似，除在252密码子处发 生单个碱基突变外，其余突变多数也是大片段的缺失13。 5 hMSH2、hMLH1突变检测的常用方法 由于hMSH2、hMLH1突变分散于较多的外显子中，因而给检测带来一定困难。但它 们的突变方式主要是大片段的缺失，这对cDNA扩增后电泳分离检测又是一个有很有利 的条件。目前常用的检测方法主要有以下几种：(1)扩增、检测其基因组DNA。提取组 织或淋巴细胞中

12、的基因组DNA，利用内含子、外显子交界处设计引物，分别扩增多个外 显子，然后进行琼脂糖电泳或SSCP。该方法的优点是用DNA作模板，避免了RNA操作的 繁琐与RNA酶降解的危险性，且检测完整无遗漏。缺点是需要多对引物及多次PCR，耗 资费时。Ling Xia等最近发现先前作为胚系突变的13外显子缺失，在90%以上受检者 淋巴细胞RNA中均能检查到，因此认为13外显子缺失是人群中的一种正常变异18。 这一发现对正确估计HNPCC家族成员风险率具有深远意义；(2)分段扩增患者及正常对 照hMSH2、hMLH1之cDNA，然后电泳及SSCP检测；(3)IVSP(in vitro synthesize

13、d protein) 法：即提取mRNA，反转录出cDNA，再经PCR扩增，产物进行体外转录、翻译，电泳比 较蛋白产物，根据缺陷性蛋白，再检测其基因变化；(4)检测突变相对集中的hMSH2的 exon5。由于exon5突变率约占HNPCC突变总数10%，可以将exon5的PCR产物经MSeI消 化，正常的产生69nt和17nt两个片段；而突变者产生39、30、17 3个片段。此法检查 相对热点exon5较为快捷，但漏诊率高19。 6 治疗HNPCC方法初探 目前试探性治疗方法主要有以下几种：(1)对整个大肠进行预防性筛查，手术切除 检出的同步性多发肿瘤2；(2)行全结肠切除及回直肠吻合术，防止

14、异步性多发肿瘤 的发生。由于HNPCC基因突变携带者患子宫内膜癌的危险率较高1，20，对无生育要 求的女性HNPCC患者或携带者还应行子宫及双侧附件切除术；(3)单纯切除癌灶者，应 定期进行内窥镜及宫腔镜检查，做好随访防治工作。最近John I. Risinger等报道，乳腺 癌亦是HNPCC综合征的一部分5，应予注意。 综上所述，HNPCC基因突变携带者数量较多，又缺乏明显的临床指征和有效的监 测手段，因此利用HNPCC基因研究的新成果，建立起检测HNPCC基因突变的简单、快速、 特异、敏感的基因诊断技术，采取适当的治疗方法，对提高大肠癌的早期诊断率和 治愈率、提高人口素质等方面，具有重要意

15、义。 作者单位：100083 北京医科大学病理系(刘硕、宫恩聪)；山东省枣庄市立医 院病理科(陆萍) 参 考 文 献 1 Markku A, Jukka-Pekka M, Lauri A， et al. Life-Time risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome. Int J Cancer (Pred. Oncol.), 1995, 64430. 2 Rossella F, Luca R, Carmela D, et al. Frequency and cl

16、inical features of multipe tumors of the large bowel in the general population and in patients with herediatry colorectal carcinoma. Cancer, 1996, 772013. 3 Lauri A, Altonen PP, Jukka-Pekka, et al. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis, Colorectal cancer pati

17、ents. Cancer Res, 1994, 541645. 4 Green RC, Narod SA, Morasse J, et al. Hereditary nonoplyposis colorectal cancer: Analysis of linkage to D2S123 and reveals genetic heterogeneity in seven canadian families. Am J Hum Genet, 1994, 541067.5 Toshlaki W, Tetsuichiro M, Toshio, et al. Flat adenoma as a pr

18、ecursor of colorectal carcinoma in hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. Cancer, 1996, 77627. 6 Lauri AA, Pairi P, Frdrick SL, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993, 260812. 7 Jean M. New colon cancer gene discovered. Science, 1993, 260751. 8 Henry T,L

19、ynchT, Thomas CS, et al. Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer: An updated review. Gastroenterology, 1993, 1041535. 9 Henry TL, Thomas CS, Jennifer C, et al. Identification of an HNPCC family. AJG, 1994, 89605. 10 Paivi P, Lauri AA. Genetic mapping of a locus predisposing to human colorectal cancer. Science, 1993, 260810. 11 Fredrick SL, Nicholas C, Nicolaides NP, et al. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis