原发性肝癌患者外周血GPC-3mRNA的表达与微转移的关系柏凯(一)

1、原发性肝癌患者外周血 GPC-3 mRNA勺表达与微转移的关系柏凯(一)【摘要】目的探讨原发性肝细胞癌(HCC患者外周血的 Glypican-3(GPC-3 mRNA检测用于诊断HCC早期微转移的可行性。方法采用巢式逆转录聚合酶链反响(RT-PCR技术检测39例原发性肝细胞癌(HCQ、19 例肝炎和肝硬化、 10 例转移性肝癌、 10 例肝血管瘤患者、 19 例健康献血员外周血 GPC-3mRNA水平。结果HCC患者外周血中，GPC-3mRNA 的检出率为62%(24/39),GPC-3mRNA勺检出率与肿瘤直径 77妝17/22)、 癌结节数目 67%(19/24)、临床 TNM 分期 76

2、%(19/25)、门静脉癌栓90%( 9/10)、远处转移 100%( 6/6 )等临床参数密切相关。 GPC-3mRNA 在转移性肝癌、肝炎和肝硬化、肝血管瘤患者及健康献血员外周血中均未检出。结论巢式RT-PCR佥测HCC患者外周血单核细胞 GPC-3mRNA 是一种早期发现原发性肝细胞癌血道播散的可靠而又敏感的实验方法。【关键词】肝细胞癌；GPC-3巢式RT-PCF微转移【 Abstract 】 ObjectiveToexplorethefeasibilityofGlypican-3 ( GPC-3) mRNAasamarkerofmi-crometastasisinperipheralb

3、loodofpatientswithhepat ocellularcarcinoma( HCC) .MethodsSubjectsGPC-3mRNAinperipheralbloodweredetectedby nestedreversetranscriptionpolymerasechainreaction ( RT-PCR ) in39patientswithHCC ，19hepatitisBandlivercirrhosis ，10themetastaticlivercancer ，10hepatichemangioma ，and19healthyvolunteers.ResultsGP

4、C-3mRNAwaspositiveintheperipheralbloodin24patientswithHCC62%andnegativeinpatientswithhepatitisandcirrhosis ， hemangio-ma ， metastaticlivercancerandhealthyvolunteers.TheexpressionofGPC-3mRNAw asstronglycorre-latedwithtumordiameter ， portalthrombosis ， metastasiaandTNMstage P0.05 .ConclusionsNestedRT-

5、PCRisasensitiveandreliablemethodfordet ectingcirculatingHCCcells.【Keywords】HCC;GPC-3;nestedRT-PCR;micro-metastasis早期微转移是原发性肝癌HCC难以有效诊治和病死率高的主要原因 之一，因此早期检测出外周血中的肿瘤细胞，对及早有效的综合治疗 具有重要的临床意义。血液微转移是 HCC的主要转移途径1，但血 液微转移的诊断仍然存在困难，主要是没有找到能准确反映微转移的 肿瘤分子标记物。近年来发现 Glypican-3 GPC-3与肝癌的发生开展 有密切的关系2。本研究对HCC患者的外周血进

6、行巢式RT-PCF检测， 探讨GPC-3mRNA佥作者单位:400037重庆，第三军医大学新桥医院肝 胆外科测对肝细胞癌微转移诊断的可行性。1 材料与方法1.1 研究对象 2004年 3月至 2005年 12月，第三军医大学新桥医院及 西南医院诊治的HCC患者39例、肝炎和肝硬化19例、转移性肝癌患 者10例、肝血管瘤患者 10例、健康献血员 19例。各类患者的诊断均 经组织病理学或影像学检查证实，实验操作同期进行。39例HCC患者 中，男性33例，女性6例，年龄3072岁，平均49士 12岁淇中 TNM 国际抗癌联盟第6版TNM分期标准1期、H期、皿期、W期 分别为 5例 13%、9例23%

7、、19例39%、6例 15%;伴门静 脉癌栓10例25%;伴肝外转移6例16%肿瘤直径 5cm者 22例55%;癌结节 2个以上者 24例62%;分化程度高、中、低者分别为 6 例32%、7 例36%、6 例32%血清 AF禺 31 g/者 25 例 69%。肝外转移灶的诊断依据X线、CT或彩色超声检查。转移性肝 癌的原发灶分别是直肠癌 4例、结肠癌 3例、胃癌 2例和胆 管癌1 例。其中 4例经过组织病理学检查证实，其余 6例根据影像 学及其血清学检查确诊。 10 例肝血管瘤诊断均经组织病理学证实。1.2方法标本采集采集受检者EDTA抗凝血5ml。1.2.2 单核细胞别离采用聚蔗糖 -泛影葡

8、胺密度梯度离心法别离外周血 单核细胞。细胞总RNA提取以Trizol采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取有核细 胞总mRNA,经紫外分光光度计和变性胶电泳鉴定，证明制备RNA的纯度及未被降解。合成 3卩gRNA羊本参加 20 IcDNA反响体系，参考美国Promega公司产品说明书进行cDNA合成。扩增 GPC-3mRNA寸的一级 PCR反响体系50 口1 :5 卩 lcDN模 板、5卩l10缓冲液、4卩IMgSO4 4卩ldNTP两条外引物各10pmol、5UTaqDNA 聚 合 酶 等 。 循 环 参 数:94C 3min94C 30s 57C 30s 72C 1min ,30个循环，68C延伸 7min;取出5口1 反响产物，参加内引物，继续进行第二级PCR反响。反响体系同上，循环参数同上，共 30个循环，最后72C延伸10min。扩增 GPC-3 外引物：上游引物：5'-AGACT-GCGGTGATGATGAAGAT下游弓 I 物:5'-GAGAACGATAGAAAGGGAGGGA-3'GPC-