靶向治疗鳞状细胞癌中Bmi1+肿瘤干细胞可以克服化疗抗药性、抑制其转移

1、靶向治疗鳞状细胞癌中靶向治疗鳞状细胞癌中Bmi1+肿瘤肿瘤干细胞可以克服化疗抗药性、抑制其转移干细胞可以克服化疗抗药性、抑制其转移 导师：程磊导师：程磊 教授教授 报告人：于金钊报告人：于金钊2017.4.62017.4.6期刊、作者期刊、作者期刊：期刊：Cell Stem Cell IF：22.387 22.387 发表时间：发表时间：2017.3.92017.3.9通讯作者：通讯作者：王存玉王存玉（UCLA）Part 1 研究背景研究背景Part 2 文章简介文章简介Part 3 实验方法实验方法Part 4 实验结果实验结果Part 5 结论结论ContentPart 6 讨论讨论研究背

2、景研究背景头颈鳞状细胞癌的现状头颈鳞状细胞癌的现状鳞状细胞癌是头颈癌最常见的病鳞状细胞癌是头颈癌最常见的病理类型。由于对化疗的抗药性以理类型。由于对化疗的抗药性以及复发、转移的发生，患者的五及复发、转移的发生，患者的五年生存率依然很低。有研究表明年生存率依然很低。有研究表明干细胞干细胞在其中在其中起起重要作用重要作用肿瘤干细胞理论肿瘤干细胞理论肿瘤干细胞肿瘤干细胞(CSC)(CSC)是肿瘤中具有是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞，既具备干细胞特性的一类细胞，既具备高度增殖能力与高度增殖能力与自我更新自我更新能力，能力，也具有也具有多向分化多向分化的能力。的能力。Rebecca L. Siegel

3、 et. al CA CANCER J CLIN 2016;66:730 肿瘤细胞起源的模型肿瘤细胞起源的模型克隆增殖进化模型克隆增殖进化模型：每个肿瘤细：每个肿瘤细胞均能形成新的肿瘤组织胞均能形成新的肿瘤组织肿瘤干细胞假说肿瘤干细胞假说：肿瘤干细胞能：肿瘤干细胞能形成新的肿瘤组织形成新的肿瘤组织Bmi1Bmi1基因基因全称：全称： B 细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点 1(B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1) 前期研究显示：前期研究显示：Bmi1与肿瘤干细胞的自

4、我更新、侵袭性生长、化疗与肿瘤干细胞的自我更新、侵袭性生长、化疗抗药性密切相关抗药性密切相关Sudha Krishnamurthy,et al. Cancer Res.70, 99699978.2010Yang, et al. Nat. Cell Biol. 12, 982992. 2010前期研究存在的问题前期研究存在的问题1.肿瘤干细胞（肿瘤干细胞（CSC）介导了淋巴结转移介导了淋巴结转移、在抗药性和复发中的、在抗药性和复发中的作用作用未在未在不受干扰肿瘤模型不受干扰肿瘤模型中得到证实中得到证实2.最佳的治疗方法是什么呢？最佳的治疗方法是什么呢？文章简介文章简介1. Bmi1+肿瘤干细胞促

5、进鳞状细胞癌的侵袭，肿瘤干细胞促进鳞状细胞癌的侵袭，转移和抗药性分发生转移和抗药性分发生2. Bmi1+肿瘤干细胞激活蛋白肿瘤干细胞激活蛋白1（AP-1）活性）活性升高升高3.联合针对联合针对Bmi1+细胞和整体细胞的治疗预细胞和整体细胞的治疗预后更好后更好实验一实验一实验目的：实验目的：探究探究Bmi1能否标记肿瘤干细胞能否标记肿瘤干细胞实验设计：实验设计：1.建立化学诱导模型建立化学诱导模型2.谱系示踪探究谱系示踪探究Bmi1+细胞的细细胞的细胞命运胞命运谱系示踪谱系示踪Bmi1Cre-ERTtdTOMATOSTOPBmi1Cre-ERTtdTOMATO他莫西芬时间特异性定义：定义：细胞的

6、命运决定是指细胞的命运决定是指单个细胞及其所有后代细胞的分化和发育活动单个细胞及其所有后代细胞的分化和发育活动， 对细胞的命运决定进行追踪和观察称为细胞谱系示踪对细胞的命运决定进行追踪和观察称为细胞谱系示踪 表达表达Bmi1的细胞会产生的细胞会产生环化重组酶环化重组酶- -雌激素受体复合体（雌激素受体复合体（Cre-ERCre-ERT T） ，在有，在有他莫西芬他莫西芬激活时，可以切除激活时，可以切除“STOP” 序列，序列， 标志基因（红色荧光蛋白）标志基因（红色荧光蛋白）就能成功表达。且就能成功表达。且其所有子代细胞均被标记其所有子代细胞均被标记实验一实验一 Bmi1正常细胞中靠近正常细胞

7、中靠近上皮基底层和靠近基底膜上皮基底层和靠近基底膜，而在而在病变组织病变组织中表达增高中表达增高。在良性乳头状瘤和在良性乳头状瘤和鳞状细胞癌鳞状细胞癌中有表达。中有表达。具有自我更新、分化能力具有自我更新、分化能力Bmi1+在侵袭的前沿，具有自我更新能力在侵袭的前沿，具有自我更新能力Bmi1+细胞具有分化能力细胞具有分化能力慢周期、转移癌中有表达慢周期、转移癌中有表达Bmi1+细胞增殖活动不活跃细胞增殖活动不活跃淋巴结转移瘤中也发现淋巴结转移瘤中也发现Bmi1+细胞，随着时间数量增多细胞，随着时间数量增多实验一结论：实验一结论：Bmi1可以作为干细胞的标志物可以作为干细胞的标志物实验二实验二实

8、验目的：实验目的：探究探究Bmi1+细胞的成瘤能力和化疗敏感性细胞的成瘤能力和化疗敏感性实验设计：实验设计：1.流式细胞术分选小鼠舌癌原发灶中的流式细胞术分选小鼠舌癌原发灶中的Bmi1+细胞细胞2.通过体外成球实验、皮下移植瘤实验探究成瘤能力通过体外成球实验、皮下移植瘤实验探究成瘤能力3.对荷瘤小鼠进行顺铂治疗，观察反应对荷瘤小鼠进行顺铂治疗，观察反应成球实验、皮下移植实验成球实验、皮下移植实验成球试验：成球试验： Bmi1+细胞成球细胞成球更大且更多更大且更多，且，且稳定稳定可遗传可遗传。异位移植：异位移植： Bmi1+细胞成瘤更大，更少的细胞便可成瘤细胞成瘤更大，更少的细胞便可成瘤原位瘤实

9、验原位瘤实验原位移植：原位移植： Bmi1+细胞细胞成瘤能力强于成瘤能力强于Bmi1-细胞细胞Bmi1+细胞颈淋巴结转移细胞颈淋巴结转移能力能力 比比Bmi1-细胞细胞强强对顺铂的敏感性对顺铂的敏感性顺铂处理后，增殖活性细胞减少顺铂处理后，增殖活性细胞减少，Bmi1+细胞却增多细胞却增多凋亡免疫荧光：凋亡免疫荧光：顺铂诱导的凋亡，主要发生在顺铂诱导的凋亡，主要发生在Bmi1-细胞细胞。顺铂处理后的谱系示踪顺铂处理后的谱系示踪Bmi1+细胞在后续抗药细胞在后续抗药/ /复发复发细胞细胞中存留中存留实验二结论：实验二结论：Bmi1+干细胞具有高度成瘤能力干细胞具有高度成瘤能力和化疗抗药性和化疗抗药

10、性实验三实验三实验目的：实验目的：探究探究Bmi1+细胞细胞与与侵袭性生长侵袭性生长、转移转移的关系的关系实验设计：实验设计：1.杂交手段得到杂交手段得到剔除剔除Bmi1+细胞的小鼠，细胞的小鼠，并建立化学诱导肿瘤模型并建立化学诱导肿瘤模型2.顺铂处理，观察反应顺铂处理，观察反应实验分组：实验分组：1.剔除剔除Bmi1+细胞细胞2.顺铂顺铂3.剔除剔除Bmi1+细胞细胞+顺铂顺铂4.对照组对照组实验结果实验结果剔除剔除Bmi1+细胞细胞后的小鼠后的小鼠，出现了细胞凋亡，出现了细胞凋亡谱系追踪：证实了谱系追踪：证实了确实确实剔除了剔除了Bmi1+细胞。细胞。病损面积方面：病损面积方面：剔除剔除B

11、mi1+细胞细胞和顺铂治疗、联合治疗与对照组相比均减少。和顺铂治疗、联合治疗与对照组相比均减少。SCCSCC数量数量：剔除剔除Bmi1+细胞后细胞后数量数量明显下降。明显下降。联合治疗的效果强于单独使用顺联合治疗的效果强于单独使用顺铂铂侵袭程度：可以看到剔除侵袭程度：可以看到剔除Bmi1+细胞之后侵袭程度降低，联合治疗的效果最好。细胞之后侵袭程度降低，联合治疗的效果最好。增殖细胞比例：剔除增殖细胞比例：剔除Bmi1+细胞之后增殖细胞的比例下降，顺铂处理组比例更细胞之后增殖细胞的比例下降，顺铂处理组比例更低，联合治疗组效果最好。低，联合治疗组效果最好。剔除剔除Bmi1+细胞后淋巴结转移有下降，细

12、胞后淋巴结转移有下降，而顺铂处理组无统计学差异。而顺铂处理组无统计学差异。联合治疗组的效果最佳联合治疗组的效果最佳实验三结论：实验三结论：鳞状细胞癌的侵袭和转移需要鳞状细胞癌的侵袭和转移需要Bmi1+ 细胞的参与细胞的参与实验四实验四实验目的：实验目的：调查抑制调查抑制Bmi1的作用联合顺铂的使用对肿瘤的作用联合顺铂的使用对肿瘤细胞的影响细胞的影响实验设计：实验设计：对成瘤小鼠使用对成瘤小鼠使用Bmi1抑制物抑制物PCT-209和顺铂，和顺铂，并做病理分析并做病理分析实验分组：实验分组：1.Bmi1抑制剂抑制剂2.顺铂顺铂3.Bmi1抑制剂抑制剂+顺铂顺铂4.对照组对照组实验结果实验结果Bmi

13、1抑制抑制剂和顺铂单独使用均可降低病损面积、不典型增生数量和剂和顺铂单独使用均可降低病损面积、不典型增生数量和SCC数数量，但联合治疗作用更明显量，但联合治疗作用更明显肿瘤的侵袭程度肿瘤的侵袭程度：三组均有所好转，但联合治疗组程度：三组均有所好转，但联合治疗组程度最轻最轻Bmi1+细胞细胞：顺铂治疗顺铂治疗后增多后增多，PTC-209治疗后治疗后则显著减少则显著减少，二者合用作用最强二者合用作用最强增殖细胞数量增殖细胞数量：和和PTC-209相比，顺铂显著减少了相比，顺铂显著减少了，二者合用作用最强二者合用作用最强颈淋巴结转移颈淋巴结转移方面：方面：联合治疗转移最少联合治疗转移最少，顺铂组无统

14、计学意义，顺铂组无统计学意义谱系示踪：联合治疗谱系示踪：联合治疗最能最能减少转移癌中减少转移癌中Bmi1+干细胞来源肿瘤细胞的生长。干细胞来源肿瘤细胞的生长。实验四结论：实验四结论：联合治疗能有效地抑制联合治疗能有效地抑制HNSCC的生长、侵袭和转移的生长、侵袭和转移实验五实验五实验目的：实验目的：复发肿瘤对联合治疗的反应复发肿瘤对联合治疗的反应实验设计：实验设计：建立复发模型，再次给予联合治疗建立复发模型，再次给予联合治疗实验分组：实验分组：1.PTC-209顺铂组顺铂组2.对照组对照组在复发肿瘤中，可见在复发肿瘤中，可见Bmi1+细胞细胞再次给予联合治疗，再次给予联合治疗， Bmi1+细胞

15、数量减少细胞数量减少再次给予联合治疗，肿瘤细胞中增殖细胞比例降低，凋亡细胞比例升高再次给予联合治疗，肿瘤细胞中增殖细胞比例降低，凋亡细胞比例升高实验五结论：实验五结论：复发瘤对联合治疗依然敏感复发瘤对联合治疗依然敏感实验六实验六实验目的：实验目的：探究联合治疗是否可以直接消除转移癌中的探究联合治疗是否可以直接消除转移癌中的Bmi1+细胞细胞实验设计：实验设计：对已有转移癌的小鼠进行联合治疗对已有转移癌的小鼠进行联合治疗实验分组：实验分组：1.Bmi1抑制剂抑制剂2.顺铂顺铂3.Bmi1抑制剂抑制剂+顺铂顺铂4.对照组对照组实验六结论：实验六结论：已有已有转移癌的动物，联合治疗相比于单独治疗可以

16、转移癌的动物，联合治疗相比于单独治疗可以减少增殖细胞和减少增殖细胞和Bmi1+的数量的数量。实验七实验七实验目的：实验目的：探究探究Bmi1+作用的机制作用的机制实验设计实验设计: :进行进行Bmi1+和和Bmi1-细胞的细胞的RNARNA测序测序、RT-PCR和荧光染和荧光染色色实验结果：实验结果：激活蛋白激活蛋白1（AP-1）依赖性依赖性目标基金在目标基金在Bmi1+细胞中明细胞中明显上调显上调。实验目的：实验目的：探究探究增高的增高的AP-1与与Bmi1+细胞的侵袭性细胞的侵袭性生长和转移生长和转移的关系的关系实验设计：实验设计：对荷瘤小鼠进行对荷瘤小鼠进行AP-1抑制剂抑制剂(3-PA

17、)的治的治疗，观察反应疗，观察反应实验分组：实验分组：1.AP-1抑制剂抑制剂2.顺铂顺铂3.AP-1抑制剂抑制剂+顺铂顺铂4.对照组对照组3-(5-(4-(cyclopentyloxy)-2-hydroxybenzoyl)-2-(3-hydroxybenzodisoxazol-6-yl)methoxy)phenyl) propanoic acid (3-PA全称) 单独治疗可以减少病损单独治疗可以减少病损面积和鳞状细胞癌的数面积和鳞状细胞癌的数量，但联合治疗效果更量，但联合治疗效果更好好顺铂治疗组：更有力的减少了增殖细胞，但顺铂治疗组：更有力的减少了增殖细胞，但Bmi1+细胞增多细胞增多抑制

18、剂治疗组：有效的减少了抑制剂治疗组：有效的减少了Bmi1+细胞细胞联合治疗组联合治疗组:减少了减少了Bmi1+细胞和增殖细胞细胞和增殖细胞，侵袭程度最轻，侵袭程度最轻谱系追踪：谱系追踪：3-PA 3-PA 和顺铂相比，抑制了和顺铂相比，抑制了Bmi1+细胞来源细胞细胞来源细胞的的生长生长，联合治疗组效果最好。联合治疗组效果最好。实验七结论：实验七结论：增高的增高的AP-1AP-1介导介导Bmi1+细胞的侵袭性生长和转移细胞的侵袭性生长和转移实验八实验八实验目的：实验目的：探究探究抑制抑制Bmi1能否能否克服人头颈癌干细胞的化疗抗药性，预防转移克服人头颈癌干细胞的化疗抗药性，预防转移实验设计：实

19、验设计：1.使用流式细胞术分选人头颈癌干细胞，并行使用流式细胞术分选人头颈癌干细胞，并行RNA测序测序2.建立原位移植瘤模型建立原位移植瘤模型3.对荷瘤进行对荷瘤进行Bmi1抑制剂治疗抑制剂治疗实验分组：实验分组：1.Bmi1抑制剂抑制剂2.顺铂顺铂3.Bmi1抑制剂抑制剂+顺铂顺铂4.对照组对照组RT-PCRRT-PCR提示提示AP-1AP-1的活性异常升高。的活性异常升高。肿瘤体积：肿瘤体积：联合治疗组最有效。联合治疗组最有效。淋巴结转移：联合治疗组效果明显。淋巴结转移：联合治疗组效果明显。同样的方法去检测同样的方法去检测AP-1AP-1抑制剂抑制剂的作用。的作用。结果相似结果相似。实验八结论：实验八结论：抑制抑制Bmi1+细胞或者细胞或者AP-1AP-1可以可以克服人头颈癌干细胞的化疗抗克服人头颈癌干细胞的化疗抗药性，预防转移药性，预防转移实验结论实验结论1.Bmi1+肿瘤干细胞介导了鳞状细胞的肿瘤干细胞介导了鳞状细胞的发生、侵袭性生长和淋巴结转移发生、侵袭性生长和淋巴结转移