大肠杆菌的磷酸转移酶系统

1、大肠杆菌的磷酸转移酶系统专业：计算机科学与技术生物信息处理方向姓名：张锂倩手写签名：班级：一班学号：20107660159大肠杆菌的磷酸转移酶系统Thephosphotransferasesystem(PTS)ofE.coli摘要:细菌是种非常节俭又聪明的细胞生物体，他们的体积小，新陈代谢快，许多情况下都生存在恶劣的环境当中，因而在长期进化过程中产生了一套巧妙的方法以适应其接触的环境，以达到最好的物尽其用。细菌的磷酸转移酶系统，通常缩写为PTS,正是这些方法当中的一个典型例子。通过PTS的作用机制，即在糖酵解等生化反应当中的磷酸化和去磷酸化的基团转移过程以达到细菌细胞中糖的转运与分配，对于细菌

2、的物质，能量利用，碳水化合物运转代谢，分解物代谢阻遏,碳源储备与平衡乃至整个新陈代谢系统都起着至关重要的作用。PTS是运载体家族当中的转位分子，在原核生物和古细菌中广泛存在。此处以大肠杆菌(E.coli)为例，通过对大肠杆菌的PTS的结构，功能和作用机制等各方面的初步分析与研究，进一步了解它的效应和生物影响，控制反应中产生的消极影响，以便更好地应用在工业等方面的生产当中提高效率。1 关键词：磷酸转移酶系统；E.coli;糖酵解；磷酸基团转移；Abstract:Bacteriaisverythriftyandintelligentcellorganisms,theyhavesmallsizean

3、dfastmetabolism.Butinmanycasestheyalwaysliveinharshenvironments,thustheydevelopedasmartwaytoadopttheenvironmenttheymeetduringthelong-termevolutionary,sothattheycanmakemostuseofresources.Phosphotransferasesystemofbacteria,usuallyabbreviatedasPTS,isatypicalexampleofthesemethods.ThroughthePTSofthemecha

4、nism,thephosphorylationanddephosphorylationofthegrouptransferprocessintheglycolyticandotherbiochemicalreactionsinordertoachieveasugartransporterdistributionofthebacterialcells,whichplaysavitalroleinbacterialsubstancesandenergyutilization,metabolismofcarbohydratesoperation,themetabolicrepressordecomp

5、osition,carbonsourcereservesandbalance,eventhewholemetabolicsystem.HeremakeE.Coliasanexample,preliminarilyanalysisandresearchvariousaspectsofthestructure,functionandmechanismofE.coliPTS,thenlearnmoreaboutitsbiologicaleffects,andcontrolnegativereactioninordertobetterapplyinindustrialandotheraspectsof

6、theproductiontoimproveefficiencyKeywords:phosphatetransferaseenzymesystem;E.coli;glycolysis;transferofphosphategroups;摘要I引言1PTS的结构与功能11.1 细菌磷酸转移酶的发现11.2 E.COLI的PTS三维结构与各蛋白组分功能12 E.COLI的PTS蛋白组分氨基酸序列3PTS的作用机制与研究方法42.1 PTS作用机制43 PTS的研究方法6PTS的生理意义与改进63.1 PTS的生理意义6PTS存在的问题与改进7结论8参考文献8引言:蛋白的磷酸化及去磷酸化状态在分解物

7、代谢阻遏中起关键作用。PTS系统是运载体家族中的转位分子，这是原核生物与古生菌独有的系统模式，在动植物体内却不存在这个系统作糖酵解中的物质转运。粗略的引入，PTS包括EI,HPr,EIIo前两者为胞质可溶型蛋白，没有底物识别特异性。分别由pstI,pstH操纵子编码；后者多为蛋白复合体，对碳水化合物具有识别特异性，可特异性识别和转运底物分子E.coli编码约20种EUs,涉及20多种不同碳化物磷酸化转运。大肠杆菌就是主要通过PEP-sugarPTS以集团转移方式进行葡萄糖的摄取。下面将从E.coli的PTS的三维复合结构域，蛋白相关组分功能，氨基酸序列，作用机制过程等多方面内容整体了解PTS的

8、相关信息，从而进一步学习细菌节俭使用资源，更好的适应不同环境而产生的巧妙机制过程。1. PTS的结构与功能1.1 细菌磷酸转移酶的发现早在1964年，Kundig,Ghosh和Roseman就给出了PEP一糖的磷酸转移酶系统这一发现的报告。30年后，我们的科学家发现PTS的功能不仅体现在糖的磷酸化系统当中，同时也作为调节大量多变的新陈代谢过程以及控制大量基因表达的复合蛋白激酶。根据最近操纵子与基因组序列的工程研究结果显示，新的PTS蛋白编码基因已被发现，其中的大部分也已经被功能性定义。他们之中有一些区别于先前已经识别的编码基因而言，显现了出与细胞作用过程相关的作用。过去以及现在相关PTS研究的

9、基本因素已简明被论述，近期的进展也被整合成概念性图片以便为将来的研究提供指导性依据。1.2 E.coli的PTS三维结构与各蛋白组分的功能我们已经知道，PTS控制着细菌中对糖的利用。在引言当中也提到了PTS的蛋白结构组分，粗略的讲述了各部分的功能与调控基因。下面将从三维图谱，文字解说各方面详细介绍其中的细节PTS由可溶性EI、磷酸组氨酸搬运蛋白HPr和EHs构成。其中，EI、HPr蛋白都是可溶性、无底物识别特异性的胞内蛋白，由ptsHI操纵子编码。EI有两个结构域：一个是N-端结构域(EIN),它用于结合Hpr；另一个是C-端结构域(EIC),它包含了二聚体界面。EI可将来自磷酸烯醇式丙酮酸(

10、PEP)的磷酰基团依次传递给HPr、Ens和葡萄糖，进而完成葡萄糖磷酸化转运。Hpr是含组氨酸的磷酸载体蛋白，有组氨酸的活性位点。磷酸化的HPr是所有PTS当中EII的磷酸通用供体。而EUs则是一系列蛋白，可以特异性识别和转运底物分子，对碳水化合物具有特异性，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EHAGlc、EHCBGlc等。E.coli编码约20种EHs,涉及20多种不同碳化物磷酸化转运，其中crr基因编码的EHAGlc以及ptsG基因编码的EnCGlc在葡萄糖磷酸化转运中起主要作用，EnAGlc蛋白的磷酸化及去磷酸化状态在分解物代谢阻遏中起关键作用。由EHCBGlc介导的高效葡萄

11、糖磷酸化转运易导致糖酵解循环和三竣酸循环的不平衡，会产生大量乙酸。图1展示了PTS的三维结构形态与蛋白组成。(图1摘自DavidS.Goodsell.BacterialPhosphotransferaseSystem.PSI.2012)1.3 E.coli的PTS蛋白组分部分相关的氨基酸序列在上一小节的介绍当中，对于PTS的三维结构我们已有了进一步的了解。在NCBI的网站上可以搜索到许多相关PTS的信息。从CN3ES个软件中也可以更清晰的看到它的立体图谱与氨基酸序列。下面将做出展示。图2和图3分别从不同的角度展示了E.coli中PTSN,N-二乙酰基壳二糖分支的EIIA溶液结构模型。（图2,图

12、3是作者在CN3E搜到此模型的三维结构图在两种不同视角下的图样截取。摘自TangC,W川iamsDC,GhirlandoR,CloreGMJ.Biol.Chem.2005）其显示的氨基酸序列如下：（图4）IKSjiicHhvveiijIiishyialkqikqgdfuihm9dqsniLilneihlvqtkliMda;qknkrilv|vhqlhtut!aeehevvmjEiinstar51availkqik（|；dfladaodqumahuh!vqtkEieedisejkmkvUvlvhaqlhltnt!/M_CndeevvcngIiinr中川口川IkqakqgdfmhnmdqsimaI

13、fluhIvqt1（IiejdagegkmkvsIvlvhaqlhlmt!图42. 注：CN3D1动态的立体三维结构图，当点击不同的氨基酸序列时会在图中作出相应色彩标注，在实际操作中会更清晰地看到。在此处只能展示一部分静态效果。因查到的资料有限，此处只能给出以EIIA为例的图解。其他不再一一给PTS的作用机制与研究方法2.1 PTS作用机制PTS在大肠杆菌可参与多种碳源的磷酸化转运。一些组成性的和可诱导的大肠杆菌葡萄糖转移系统在细胞膜上存在特定的葡萄糖识别蛋白（通透酶），同事会影响同葡萄糖磷酸化相耦连的葡萄糖转移的过程。磷酸基团的来源是细胞内的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。从能量的角度来看，PE

14、P直接磷酸化通透酶的胞质组分是可能的。然而，这个过程是非常复杂的；PTS的复杂性是由于其的多功能能力：它不仅催化糖基转移，还调控着其他系统的作用过程。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）-糖磷酸转移酶系统（PTS）穿过膜运输进外源性己糖以及从PEP紧密耦合方式运输到糖是通过几个磷酸化中间体的磷酰基实现转移的。糖类被运输随之而来的就是PTS的磷酸化。磷酸化的糖类进入糖酵解途径，通常是在葡萄糖-6-P或果糖-6-P的水平上。糖酵解途径通常会生成两分子的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）,其中一分子用来驱动运输过程以及起始糖类的磷酸化。其结果是，PTS蛋白的磷酸化状态同时依赖于细胞外糖类的浓度以及细胞内磷酸烯醇式丙酮

15、酸（PEP）和丙酮酸的比率。具体来看此循环过程，正如图5,图6（立体模拟）所示：首先，EI先与PEP反应并从PEP处获得磷酸基团，将其加载到组氨酸的磷酸载体蛋白HPr上，然后载体蛋白将磷酸基团传递给整个系列当中相对应不同的转运蛋白。磷酸基团在几种蛋白当中穿梭，从HPr移动到EIIA,再到EIIB、EIIC,与其共同作用（有时会带上一个额外的链EIID）,此时从胞外进入的碳水化合物进过这个反应便成磷酸化型碳水化合物（通常可以是葡萄糖或者果糖），然后他们就再进入糖酵解途径，生成的PEP再次循环此过程。糖类的流动与代谢进行得以推进。EII里的每个转运蛋白由EII自身的各个集成物组成，有时他们会作为隔

16、离蛋白存在，有时又会在一个长链蛋白质中作为一连串相互连结的结构区域。（图5摘自DavidS.Goodsell.BacterialPhosphotransferaseSystem.PSI.2012(10);图6摘自JosefDeutscher,ChristorFrancke,PieterW.Postma.HowPhosphotransferaseSystem-RelatedProteinPhosphorylationRegulatesCarbohydrateMetabolisminBacteria.MicrobiologyandMoleculaiBiologyReviews.2006.)Fru-

17、lt6-bisPFbaTPGlyceraldehyde-3-PEIIApEHADh并PHPrHPrpPi+NAD忆NADH*4IaPElPElPykPyruvatPhosphoenolpynivale*ATPADPEno13-bisP-glycerleADPtatp*41Pglc3-P-glycerate2-P-glycerateH2O图6图6中黑体的各个蛋白酶缩写如下:Pgi:phosphoglucoseisomerase;Pfk:phosphofructokinase;Fba:fructose-1,6-bisphosphatealdolase;Tpi：triose-phosphateiso

18、merase;Gap:glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase；Pgk:phosphoglyceratekinase;Pyk:pyruvatekinase;Eno:enolase；Pgm:phosphoglyceratemutase;2.2 PTS的研究方法我们已经知道，大肠杆菌的PEP-PTS包括一系列负责在转移过程中从磷酸烯醇式丙酮酸（PEP向葡萄糖转移磷酸基团的蛋白质。对于包含在通过PTS进行磷酸转移的过程以及PTS蛋白参与调控过程的机制的理解在很大程度上是通过蛋白组分的相互作用的种类的三维结构的可视化来实现的。人们已经利用X衍射晶体学和NMR（核磁

19、共振）对PTS的单个的蛋白（酶I、HPr、IIA）进行了广泛的特征分析。磷酸载体蛋白之间以及与调节目标之间相互作用的机制同样适合用核磁共振光谱的方法研究。EIN-HPr复合体是到现在为止被NMRB析的最大的结构之一。这个结构测定采用了为了指定的目的以及为了特异地观察EIN和HPr之间的分子间核Overhauser增强（NOE接触而利用的多种同位素标记（15N,13C和/或2H）的蛋白质的组合去简化光谱的多维异核NM班谱技术。止匕外，残基两极的耦连技术也被用来提供对于决定复合体中两个蛋白的方向极为有用的长程定向信息。NMRF究使得揭示包括PTS蛋白的蛋白一蛋白之间相互作用成为可能。目前酶I和HP

20、r之间以及HPr和IIAG1c之间的氨基末端结构域的三维结构也已成功获取。3. PTS的生理意义与改进3.1 PTS的生理意义：碳水化合物运转和代谢；分解物代谢阻遏；碳源储备；协调碳氮代谢平衡等。3.2 PTS存在的问题与改进功能型PTS介导的葡萄糖磷酸化转运以如下化学反应进行：Glucose+PEP-Glucese-6-P+Pyruvate这一反应减小了以PEP为前体的化合物的产量，积累的丙酮酸进而会转化为乙酸，这样就增加了代谢副产物大量积累，产生的乙酸盐会进一步抑制菌体生长。从而有了利在代谢工程中对PTS的分子改造进展。代谢工程就是利用重组DNA及其他技术，有目的地改变生物中已有的代谢和表

21、达调控网络，以更好地理解细胞的代谢途径，并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程目前，PTS分子改造主要有两种策略：一是敲除葡萄糖特异性转运蛋EIICBGlc（ptsG编码）；另一策略是敲除ptsHIcrr操纵子，使葡萄糖转运依赖于GalP和Glk途径（由葡萄糖特异性转运蛋白EnCBGlc（ptsG基因编码）葡萄糖通过GalP、Glk协同作用途径进入细胞的途径，是以ATP为磷酸基团供体而非消耗PEP,此途径可增加胞内PEP含量，具有减小过流代谢和解除葡萄糖效应等优势。G/ucoseGaiactoseTHTDP-Gic丁一GlycolysisUDPGIgnAgGalE2EnergyUDp，GaJ

22、NAcdTDP-4keto-6-deoxy-GicRmIB4(fTDP-4-ketQ-L-Rhe1RmID4dTDPRha图7展示了在大肠杆菌当中，葡萄糖G转化成6-磷酸葡萄糖G-6-P具有两种途径：PTS途径和Glk途径。可以配合于对PTS分子改造中的的第二种方法来看更易于理解。（图7摘自KarenL.Visick,ThereseM.OShea,AdamH.Klein,KatiGeszvain,AlanJ.Wolfe.TheSugarPhosphotransferaseSystemofVibriofischeriInhibitsbothMotilityandBioluminescence.N

23、CBI.2007.）结论：此论文用三章的内容系统的讲述了以大肠杆菌为例的原核生物的磷酸转移酶系统PTS。从中我们可以了解到，PTS的蛋白质结构组成与作用过程十分复杂，却相当有效。这是细菌利用自身巧妙的生化作用机制以达到最大程度利用有限资源的方法之一。这样他们可以更好地适应环境。所以细菌是非常聪明的。在网上各种不同的学术科研网站（尤其以英文为主）如非常熟悉的NCBI,EMBL,PDB,PIB,等中都可以查到相关的期刊文献及对应的数据库。通过查到的资料再加上自己的理解，对PTS这方面的知识有了更全面的认识，有些国外文献内容需要翻译理解，这对英语水平也是一个考察。整理好后就形成了PTS蛋白组分结构功

24、能，部分在CN3D三维结构中显示的氨基酸序列，以及PTS的作用机制与研究方法，生物学意义改进方法的进展等这些内容。我想通过对PTS的研究进展在工业应用当中诚然非常重要。因为大肠杆菌是常用的工程菌种，对它实行这种代谢途径上的控制和改造可以很好地提高细菌的利用率与工业生产。第一篇论文的完成实属不易，从没有任何经验到自己翻阅上网查资料能写出来东西并真正学到心里，这个学习的过程比只考一张无趣的卷子有意义得多。所以感谢老师能让我们有此机会，以这种方式学习到一些有用的东西。参考文献：1周军智.大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸一糖磷酸转移酶系统（PTS系统）分子改造及敲除菌性能测定.中国知网.2012.2韩聪，张惟

25、材，游松，黄留玉.大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究J.生物工程学报.2004.3李寅，曹竹安.微生物代谢工程：绘制细胞工厂的蓝图J.化工学报.2004.4张惟材，朱厚础.重组大肠杆菌的发酵与代谢工程J.微生物学通报.1999.5Cao,Y.,etal.Crystalstructureofaphosphorylation-coupledsaccharidetransporter.Nature473,50-55.2011.6Deutscher,J.,Francke,C.&Postma,P.W.Howphosphotransferasesystem-relatedproteinphos

26、phorylationregulatescarbohydratemetabolisminbacteria.Microbiol.Mol.Biol.Rev.2006.7FloresS,GossetG,FloresN,etal.AnalysisofcarbonmetabolisminEscherichiacolistrainswithaninactivephosphotransferasesystemby13ClabelingandNMRspectroscopy.MetabolicEngineering.2002.8Gutknecht.R;Manni.M;Mao.Q;Erni.B.TheJournalofBiologicalChemistry.1998.9Hu,J.,etal.SolutionNMRstructuresofproductiveandnon-productivecomplexesbet-weentheAandBdomainsofthecytoplasmicsubunitofthemannosetransporteroftheEscherichiacoliphosphotransferasesystem.J.Biol.Chem.283,2008.10Kotrba,P.Inui,M.&Yukawa,H.Bacterialphosphotr