青霉素的生产

1、项目三项目三 青霉素的生产青霉素的生产班级班级: :生物制药生物制药13111311组别：第组别：第2 2组组组员：张婉月组员：张婉月 臧赢臧赢 严梦迎严梦迎 徐洁徐洁 陈孝颜陈孝颜 青霉素的介绍 青霉素的生产步骤 青霉素接种、菌种活化、扩大培养 青霉菌发酵 发酵液质量控制 青霉菌发酵产物初步分离 青霉素发酵液效价的测定青霉素的概述青霉素的概述 青霉素（青霉素（Benzylpenicillin / PenicillinBenzylpenicillin / Penicillin）又）又被称为青霉素被称为青霉素G G、peillin Gpeillin G、 盘尼西林、配尼西盘尼西林、配尼西林、青霉

2、素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的内酰胺类中一大类抗生素的总称。总称。青霉素的结构式青霉素的结构式青霉素分类及分子结构青霉素分类及分子结构 按其特点可分为按其特点可

3、分为 ： 青霉素青霉素G G类：如青霉素类：如青霉素G G钾、青霉素钾、青霉素G G钠、长效西林钠、长效西林 青霉素青霉素G G、peillin Gpeillin G、 盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾等。霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾等。 青霉素青霉素V V类：（别名：苯氧甲基青霉素、类：（别名：苯氧甲基青霉素、6-6-苯氧乙酰胺基苯氧乙酰胺基青霉烷酸）青霉烷酸） 如青霉素如青霉素V V钾等（包括有多种剂型）。钾等（包括有多种剂型）。 耐酶青霉素：如苯唑青霉素（新青耐酶青霉素：如苯唑青霉素（新青号）、氯唑青霉素等。号）、氯唑青霉素

4、等。 氨苄西林类：如氨苄西林、阿莫西林等。氨苄西林类：如氨苄西林、阿莫西林等。 抗假单胞菌青霉素：如羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等。抗假单胞菌青霉素：如羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等。 美西林及其酯匹西林：如美西林及其酯匹美西林等，其特美西林及其酯匹西林：如美西林及其酯匹美西林等，其特点为较耐酶，对某些阴性杆菌（如大肠、克雷伯氏和沙门点为较耐酶，对某些阴性杆菌（如大肠、克雷伯氏和沙门氏菌）有效，但对绿脓杆菌效差。氏菌）有效，但对绿脓杆菌效差。 甲氧西林类：如坦莫西林等甲氧西林类：如坦莫西林等青霉素的生产步骤青霉素的生产步骤 生产青霉素需经以下步骤生产青霉素需经以下步骤：配料、发酵、过滤、提取、

5、结晶、干燥、包配料、发酵、过滤、提取、结晶、干燥、包装。装。青霉素的发酵工艺过程青霉素的发酵工艺过程一、菌种：保养在低温的冷冻安瓿管中丝状一、菌种：保养在低温的冷冻安瓿管中丝状青霉菌菌种青霉菌菌种二：所用培养基：二：所用培养基：LBLB培养基培养基配方：牛肉膏配方：牛肉膏1g1g、蛋白胨、蛋白胨2g2g、Nacl1gNacl1g、琼脂、琼脂3g3g、葡萄糖、葡萄糖4g4g、配成、配成200mL200mL青霉素接种、菌种活化、扩大培养青霉素接种、菌种活化、扩大培养一、接种（在超净台上完成）一、接种（在超净台上完成） 将灭好菌的将灭好菌的LBLB培养基放入超净台中培养基放入超净台中 将将LBLB培

6、养基倒入试管中，试管摆斜面冷却培养基倒入试管中，试管摆斜面冷却凝固。凝固。 等培养基凝固后，用接种环从安瓿中接去等培养基凝固后，用接种环从安瓿中接去菌种，并在培养基上画菌种，并在培养基上画S S型曲线接种型曲线接种二、菌种活化二、菌种活化待接种好的菌吸附在培养基上，置于待接种好的菌吸附在培养基上，置于2525恒恒温箱中培养温箱中培养5 5天。天。三，扩大培养三，扩大培养 1 1、液体试管培养液体试管培养 液体培养基配方：可溶性淀粉液体培养基配方：可溶性淀粉9g9g、 蛋白胨蛋白胨1.2g 1.2g 、 玉米浆玉米浆2ml2ml、葡萄糖、葡萄糖3g3g、 K K2 2HPOHPO4 40.15g

7、 0.15g 、 MgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.15gO 0.15g、 NaCl0.15g NaCl0.15g、 蒸馏水蒸馏水300ml300ml。 . . 灭菌后，在超净工作台进行以下操作：灭菌后，在超净工作台进行以下操作： 将液体培养基倒入试管内，用接种环自斜面将液体培养基倒入试管内，用接种环自斜面试管挑取一环斜面种子菌体，接入试管中。摇匀后，试管挑取一环斜面种子菌体，接入试管中。摇匀后，置培养箱培养。待培养成熟后，再接入三角瓶培养。置培养箱培养。待培养成熟后，再接入三角瓶培养。2 2、三角瓶液体培养三角瓶液体培养 制备液体培养基（同上）灭菌后，在超制备液体培养基（同上）灭菌

8、后，在超净台进行以下操作：净台进行以下操作： 将液体培养基倒入三角瓶内，用接种环将液体培养基倒入三角瓶内，用接种环自液体培养的试管挑取种子菌体，接入三角自液体培养的试管挑取种子菌体，接入三角瓶（可接瓶（可接2-32-3次）。摇匀后，置摇床培养。次）。摇匀后，置摇床培养。 发酵罐：生产罐。发酵罐：生产罐。 培养基配方：花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，培养基配方：花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，胺及消泡剂，CaCOCaCO3 3等。等。 从三角瓶中接种，接种量为从

9、三角瓶中接种，接种量为12-15%12-15%。 青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.7-1.80.7-1.8；150150200r/min200r/min；要求高功率搅拌，；要求高功率搅拌，100 m3100 m3的发酵的发酵罐搅拌功率在罐搅拌功率在200-300 Kw200-300 Kw，罐压控制，罐压控制0.04-0.05 MPa0.04-0.05 MPa，于，于25-25-26 26 下培养，发酵周期在下培养，发酵周期在200h200h左右。前左右。前60h60h，pH5.7-6.3pH5.7-6.3，后，后6.3-6

10、.66.3-6.6；前；前60h60h为为2626，以后，以后2424。青霉菌发酵青霉菌发酵发酵液质量控制发酵液质量控制 生产上按规定时间从发酵罐中取样生产上按规定时间从发酵罐中取样 , , 用显微用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称“ “ 镜检镜检 ”, ”,根据根据“ “ 镜检镜检 ” ”中菌丝形变化和代谢中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度变化的其他指标调节发酵温度, , 通过追加糖或补通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间加前体等各种措施来延长发酵时间, , 以获得最多以获得最多青霉素。青霉素。 当菌丝中空泡扩大、增多及延

11、伸当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, , 并出现个别并出现个别自溶细胞自溶细胞, , 这表示菌丝趋向衰老这表示菌丝趋向衰老, , 青霉素分泌逐青霉素分泌逐渐停止渐停止, , 菌丝形态上即将进入自溶期菌丝形态上即将进入自溶期, , 在此时期在此时期由于茵丝自溶由于茵丝自溶, , 游离氨释放游离氨释放, pH , pH 值上升值上升, , 导致青导致青霉素产量下降霉素产量下降, , 使色素、溶解和胶状杂质增多使色素、溶解和胶状杂质增多, , 并使发酵液变蒙古稠并使发酵液变蒙古稠, , 增加下一步提纯时过滤的增加下一步提纯时过滤的困难。因此困难。因此, , 生产上根据生产上根据“镜检镜检 ” ”判断判断

12、, , 在自溶在自溶期即将来临之际期即将来临之际, , 迅速停止发酵迅速停止发酵, , 立刻放罐立刻放罐, , 将将发酵液迅速送往提炼工段。发酵液迅速送往提炼工段。青霉菌发酵产物初步分离青霉菌发酵产物初步分离（1 1）预处理及过滤）预处理及过滤 发酵液放罐后需冷却至发酵液放罐后需冷却至1010后，经鼓式真空过滤机过滤。从鼓式真空过滤机得后，经鼓式真空过滤机过滤。从鼓式真空过滤机得到青霉素滤液到青霉素滤液pHpH在在6.26.2 7.27.2，蛋白质含量一般在，蛋白质含量一般在0.05%0.05% 0.2%0.2%。这些蛋白质的存在对后面提取有很大。这些蛋白质的存在对后面提取有很大影响，必须加以

13、除去。除去蛋白质通常采用影响，必须加以除去。除去蛋白质通常采用10%10%硫硫酸调节酸调节pH4.5pH4.5 5.05.0，加入，加入0.05%0.05%（质量浓度）左右的（质量浓度）左右的絮凝剂的方法，同时再加入絮凝剂的方法，同时再加入0.7%0.7%硅藻土作助滤剂，硅藻土作助滤剂，再通过板框过滤机过滤。经过第二次过滤的滤液一再通过板框过滤机过滤。经过第二次过滤的滤液一般澄清透明，可进行萃取。般澄清透明，可进行萃取。（2 2）提取）提取 结合青霉素在各种结合青霉素在各种pHpH下额稳定性，一般下额稳定性，一般从发酵液中萃取到醋酸丁酯时，从发酵液中萃取到醋酸丁酯时，pHpH选择在选择在1.8

14、1.8 2.22.2范范围内，而从丁酯相反萃取到水相时，围内，而从丁酯相反萃取到水相时，pHpH选择在选择在6.86.8 7.47.4范围内对提取有利。生产上一般将发酵滤液范围内对提取有利。生产上一般将发酵滤液酸化至酸化至pHpH等于等于2.02.0，加，加1/31/3体积的醋酸丁酯（简称体积的醋酸丁酯（简称BABA）混合后以卧式离心机（混合后以卧式离心机（PODPOD）机分离的一次）机分离的一次BABA萃取萃取液，然后以液，然后以NAHCONAHCO3 3在在pH6.8pH6.8 7.47.4条件下将青霉素从条件下将青霉素从BABA中萃取到缓冲液中，再用中萃取到缓冲液中，再用10%H10%H

15、2 2SOSO4 4调节调节pHpH等于等于2.02.0，将青霉素从缓冲液中再次转入将青霉素从缓冲液中再次转入BABA中（方法同前面所中（方法同前面所述），得二次述），得二次BABA萃取液。萃取液。（3 3）脱色）脱色 在二次在二次BABA萃取液中加入活性炭萃取液中加入活性炭150350g/10150350g/10亿单位，进行脱色，石棉过滤板过滤。亿单位，进行脱色，石棉过滤板过滤。注意注意：青霉素性质不稳定，在发酵液预处理、提取和精制过：青霉素性质不稳定，在发酵液预处理、提取和精制过程中应注意条件温和、速度快，以防止青霉素破坏。预处程中应注意条件温和、速度快，以防止青霉素破坏。预处理及过滤、提

16、取过程是青霉素各产品的共性部分，其工艺理及过滤、提取过程是青霉素各产品的共性部分，其工艺控制基本相同，只是精制过程有所差别。控制基本相同，只是精制过程有所差别。青霉素发酵液效价的测定 根据发酵时间用1%pH6.0的磷酸缓冲液将发酵液适当稀释.每个被测样品用3套平皿进行测定.青霉素标准液(1单位/ml)与待测样品的稀释液间隔的加入小管内.37培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小。测定步骤 （1）青霉素发酵：用摇瓶或台式发酵罐法接种与培养产黄青霉（青霉素高产分泌菌株） （2）稀释发酵液：作青霉素测定的发酵液用1%pH6.0磷酸盐缓冲液作适当稀释，每个被检验样品用3套培养皿测定其效价。 （3）放牛津小杯:每套含菌测定平半上均匀地放置4支牛津小杯，小杯中心坐落在培养皿两互相垂直直径的各自半径的中心。测定步骤 （4）杯中加样品液：青霉素标准液（1U/ml）与发酵液的稀释液间隔地加入牛津小贝中，加液量务求准确，