胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定-

1、胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定王勇,马武华,钟 鸣,王可佳(广州中医药大学第一附属医院麻醉科,广州510405中图分类号:R614;R743.31 文献标识码:A 文章编号:1006-2084(201207-1088-03摘要:目的 建立较理想的S D 大鼠胎鼠海马神经细胞体外原代培养方法。方法 孕18d(E18S D 大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法进行海马神经元的原代无血清培养。结果 在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化,并能形成典型的神经细胞网络。结论 该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。关键词:胎鼠;海马神经元;原代培养Primary Cult ure and

2、 Identificat ion of Hippocampal Neuro ns of Fetal Rat Neurons WANG Yong,MA W u-hua,ZHONG Ming,W ANG Ke-jia.(Depar tm ent of Anesthes iology,the Firs t Affliated Hospital of Guang-zhou University of Tr aditional C hines e Medicine,Guangz hou 510405,ChinaAbst rac t:Objective To establish a better pr i

3、mary culture method for the primar y culture for hipocam-pal neur ons of SD fetal ra ts.Met ho ds Trypsin digestion a nd mechanical dissociation wer e a dopted to con-duct monolayer pr imary culture.Res ults Under the culture condition in vitro,fetal rat neurons showed simi-lar for m proper ties to

4、their counter par ts in v ivo and typical nerve fiber net was formed.Conclusion This technique is an ideal tool for culture in vitro for neurons of hippocampal tissue.Key words :Fetal ra t;Hippocampal neurons;Primar y culture海马是神经元高度集中的部位,具有中枢神经系统的典型特性,在学习、记忆、情绪反应及自主神经功能等方面发挥重要作用。而海马又是癫痫、缺血/缺氧、神经变性疾

5、病的主要病灶。神经元细胞培养模型是研究神经元发育分化、神经再生、神经疾病的发生机制等重要的实验模型1。海马细胞的原代培养方法文献报道不一,总体可以分为有血清培养和无血清培养两种。有血清培养,血清可以提供细胞生长所必需的营养成分,可以促进细胞的增生和D NA 的合成,但由于血清成分复杂,对于要求较高的实验研究结果影响较大。无血清培养步骤简便,培养的细胞活性及生理特性保持良好,具有较大的优越性。为了研究中药对海马神经元发育的影响,本课题组采用无血清培养方法,建立Spra gue-Daw ley(S D大鼠胎鼠的海马神经元体外培养模型,并对其进行形态学观察及纯度鉴定,获得了一种简便可行、易于生长的培

6、养方法。1 材料与方法1.1 材料免疫组化试剂盒(即用型(武汉博士德生物工程有限公司。配置好的50g/m L 多聚赖氨酸溶液800L 加入6孔培养板中,轻轻晃动,使多聚赖氨酸溶液覆盖培养板或培养瓶底面,置37,5%CO 2培养箱内放置过夜,吸弃多余的多聚赖氨酸溶液,并用PBS 轻轻荡洗两次,置培养箱中备用。细胞悬液0.1m L计数。根据计数结果,调整细胞终浓度为2×106个/mL。按5×1057×105个/cm2接种于包被好的培养板中,12h内禁止晃动。酮固定10m in。用PBS液冲洗3遍,3%H2O2(30%双氧水和纯甲醇按19的溶剂比混合封闭内源性过氧化物酶

7、,室温下10m in。PBS洗3遍, 0.3%Triton破膜(溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质15min,PBS洗3遍。10%羊血清封闭,室温10min。吸弃血清(不洗。一抗37反应1h (20L NS E+1mL稀释液;设空白对照,以PBS液代替一抗。PBS洗3×5m in,二抗(羊抗兔室温下18m in,PBS洗3×5min,SABC复合物37、18min。PBS洗3×5min,DAB显色(5min。镜下观察,自来水终止。DAB稀释度(150,苏木素复染(3min。95%乙醇脱水,二甲苯透明20m in,中性树胶封固。风干,镜下观察。2 结果2.1 相

8、差显微镜下观察原代培养大鼠海马神经元形态学改变海马神经细胞接种时呈圆球形,相差显微镜下观察可见明显光晕,一般12h开始贴壁,呈扁平圆形生长,有小的集落生成。12h后大部分细胞均已贴壁,呈圆形,周围有光晕,少数细胞伸出一至两个突起(图1-A。24h后突起一般20 40m,生长状况良好的细胞透亮匀质,开始铺展,突起变粗变长,并出现末端分支,同时由于有部分已贴壁的神经元和胶质细胞的死亡,背景出现许多细小的球形体(图1-A。3d后突起进一步增多并形成稀疏的网状,胞体逐渐长大,光晕良好,轴突和树突逐渐延伸,邻近神经细胞突触之间形成神经网络(图1-C。实验中选取培养79d的神经细胞,此时细胞呈锥体状或多极

9、形,胞体丰满,胞核大,仅见极少胞质,胞质透亮,胞周光晕明显,立体感强,有很强的折光性,胞体突起较长且较完整,细胞核呈圆形或卵圆形,常偏于胞体一侧,内有12个核仁,神经细胞突起相互交织成网状,神经细胞的纯度高,几乎难以看见多形和梭形的星状胶质细胞和小胶质细胞(图1-D。A培养12h(×200B培养24h(×100C培养3d(×200D培养7d(×200图1 培养的海马神经元2.2 免疫细胞化学染色鉴定结果普通光学显微镜下可见大部分细胞(>90%NS E免疫阳性颗粒位于神经细胞核周质及核突起中(呈棕黄色,细胞核不染色,为一圆形或椭圆形淡然区,此类细胞为神经元(图2-A;空白对照(以PBS为一抗仅见细胞核呈蓝色,胞体及突起均不着色(图2-B。表明本培养方法可得到纯度较高的大鼠海马神经元细胞。A NS E抗体染色(×400B PBS染色(×400图2 海马神经元鉴定3 讨论大脑海马部位的神经元高度集中,是中枢神经系统中最易受缺血/缺氧等因素影响造成损伤的部位之一,并与人体多种生理功能密切相关;海马神经元细胞培养排除了整体实验中循环、体液、内分泌及血脑屏障等复杂因素的影响,是研究脑缺血/缺氧相关机制的行之有效的实验模型。神经组织的分离细胞培养是神经组织体外培养技术的