老年性痴呆相关基因ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区单核苷酸多态性分析

1、    老年性痴呆相关基因启动子区单核苷酸多态性分析作者：李中， 丘东海， 刘红英， 方莹莹   作者单位：中山大学附属第一医院神经科， 广东 广州 【摘要】  【目的】 分析老年性痴呆（病）相关基因启动子区单核苷酸多态性（），探讨其基因表达可能的分子调控机制。【方法】 扩增基因上游约 启动子区片段，与萤火虫荧光素酶报告基因载体-进行重组质粒的克隆与鉴定，确立启动子区候选功能及其相应位点结合的转录调节因子。应用 对包含功能的重组质粒进行-细胞瞬时转染，双荧光素酶相对活性分析及电泳迁移率变动分析。【结果】 基因启动子

2、区 片段内存在功能 - ，与其相应位点结合的转录因子为 （）， - 的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较 - 的序列结构强（ ， ）。 【结论】 基因核心启动子应该在 片段内， - 可能是启动子区有功能位点突变，包含 - 的核苷酸序列结构可能通过与在内的转录调节因子的作用来实现对基因表达差异的调控。【关键词】  病；启动子；单核苷酸多态性；电泳迁移率变动分析            ， -， -， -    （ ， ， - ， ， ） 

3、0;  ： 【】 （） （） 【】 - （） - （） （）   【】 - ， （） - - （ ，） 【】 - ， -   ： ； ； ； ；     老年性痴呆又称病（ ， ），是一种以进行性记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统退行性变性疾病。随着社会经济的发展，人类寿命普遍延长，发病率呈逐年上升趋势，但是， 的病因学和发病机制至今尚不明了，亦无有效治疗方法。研究发现，淀粉样蛋白（- ， ）沉积（老年斑形成）是脑神经细胞主要变性区域的核心病理特征之一，并能导致其他病理结构的出现，。来源于脑内分泌酶（-）对型跨膜蛋白（- ）

4、跨膜区的切割。分泌酶是一种大分子质量多蛋白复合体， 由-、 、 -和-四种蛋白组成，缺一不可，相互起着稳定因子的作用，其中任一种蛋白表达水平的变化将直接影响其他蛋白的稳定性、水解成熟、糖基化或向细胞表面的运输，进而影响分泌酶的活性，产生难以消除的不可溶性片断，导致脑内沉积。本文将从相关基因启动子区研究入手，分析研究基因启动子区单核苷酸多态性（ ， ）及其转录因子结合位点（ ， ）情况，探讨基因启动子区表达调控的分子机制，期望能为阐明该基因表达调控与分泌酶功能以及发病相关性提供新的线索和实验依据，为进一步揭示发病机制和为临床寻找防治新的药物及其他干预治疗手段打下基础。  &#

5、160;    材料和方法      材  料    大肠杆菌感受态细胞和-细胞株（来源于人脑神经母细胞）为本室保存。-和-萤火虫荧光素酶报告基因载体、-水母荧光素酶载体及双荧光素酶活性分析试剂盒均为公司产品；反应、产物纯化以及质粒提取试剂盒均为公司产品；限制性内切酶、及 连接酶为公司产品；、-细胞培养液和胎牛血清、合成引物及探针、脂质体 均为公司产品；细胞核蛋白抽提及电泳迁移率变动分析（ ，）试剂盒为公司产品，同位素-为 公司产品。      基因启动子

6、的克隆与鉴定    登陆查询人类基因组序列，通过美国国立生物技术信息网确定基因组 翻译起始点位置并结合文献确定转录本大小及大致定位其启动子位置。结合-报告基因载体多克隆酶切位点分析设计引物， 多聚酶扩增其上游约 的片段并纯化，此扩增片段经凝胶电泳观察并测序验证。参照分子克隆（第版）相关技术指南， -与上述扩增片段进行酶切、连接、感受态细胞转化、回收阳性克隆重组质粒并双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序验证。   启动子区功能的选择及其的确立    针对上述启动子片段序列，登陆和 进行比对，推断基因启动子区的候选功能并运用

7、-的和的 数据库及程式，匹配出与候选功能相应位点结合的最可能的转录调节因子。      瞬时转染及双荧光素酶活性分析    -细胞在含 胎牛血清的高糖培养液及 、体积分数 和适合湿度的条件下传代培养。按产品说明书技术指南进行孔板脂质体 的瞬时转染。转染体系如下：每孔细胞数 × ，脂质体与质粒质量比为 ，待检及对照质粒与内对照-的质量比为 ，补充无抗生素及无血清-培养液至总体积 ；每个质粒至少单独转染次。    转染 后收集细胞，参照公司试剂盒操作手册在荧光检测仪上进行相对荧光素酶活性（

8、 ，）测定，每孔测次求均值。机器对各孔细胞转染效率通过内对照活性进行自动校正，校正后的转染活性减去阴性对照值，再除以阳性对照值，最后得到各样品相对于阳性对照启动子的相对活性。对此相对活性数据进行单样品检验和单因素方差分析，并在此基础上进行均数间两两比较（）。      电泳迁移率变动分析    设计合成包含启动子区候选功能及其相应转录调节因子结合位点在内的约 大小的核苷酸序列作为探针，并在其-末端用同位素- 标记， -过柱纯化后于 保存备用。按核蛋白抽提试剂盒说明书抽提-细胞核蛋白，并进行-蛋白质量检测。按以下程序进行-蛋白

9、结合反应： 阴性对照反应（仅有标记探针）； 阳性反应（核蛋白标记的已知探针）； 探针冷竞争反应（核蛋白标记探针倍标记探针量的同源未标记探针）； 突变探针的冷竞争反应（核蛋白 标记探针 倍标记探针量的未标记突变探针）； 突变探针的冷竞争反应（核蛋白标记突变探针倍标记突变探针量的未标记探针）。反应样品于质量浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳，干胶后线片压片并进行放射自显影检测。       结   果      基因启动子重组质粒的克隆与鉴定    根据载体多克隆酶切位点

10、，确定和两个酶切位点，运用 程序设计上下游引物分别为- - （）和- - （）， 多聚酶扩增出 大小的片段，此扩增片段和阳性克隆重组质粒及其双酶切后经质量浓度琼脂糖凝胶电泳检测结果如图，产物均经测序验证正确。      分析与  经比对，推断出 - 为基因启动子区的候选功能并匹配出与其相应位点结合的最可能的转录调节因子为 （， ， 下划线结构为）。采用带启动子与增强子的-萤火虫荧光素酶报告基因载体作为阳性对照，未连接克隆片段的空-作为阴性对照，-水母荧光素酶载体作为每个转染的内对照（用于校正背景值），由此构成双荧光素酶活性分析系统，其结果如图（

11、两两比较有统计学意义， ，），提示启动子区包含 - 的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较包含 - 的序列结构要强。进一步的分析结果也显示 - 的核苷酸序列结构能与核蛋白中的转录调节因子 结合并成为凝胶电泳迁移时相对独立的泳动带（图 ）。       讨   论    自年基因被克隆伊始，就发现它可与其他种蛋白相互作用形成分泌酶，并对脑的病理结构形成起重要作用，。属型跨膜糖蛋白，它可能作为分泌酶的底物结合位点参与酶与底物的选择性结合；因此， 表达的差异对分泌酶的功能具有一定的调节作用

12、，。    等研究发现，在人类神经元细胞系中 对早老素功能起着关键的调节作用。等报道了荷兰人家族早发性与基因内含子多态性相关。等对基因缺陷小鼠胚胎研究认为，是分泌酶的重要组件，在介导信号通路和哺乳动物细胞的加工与运输中不可缺少。等对意大利家族性和散发性病人基因突变研究发现有相关性。    分泌酶的功能不正常可以造成的脑内异常沉积，从而产生脑的病理结构变化；因此，作为分泌酶重要组件之一的有可能与的发生发展有着密切的相关性。那么在分子水平上，的表达调控如何？它的表达调控差异是否与发病有关？该问题的解答将为揭示的发病机制与创立新的治疗途径提

13、供依据。    本文通过生物信息学技术，推断出人基因启动子区 大小的片段内存在候选功能 - 及与其相应位点结合的最可能的转录因子。在此基础上运用基因重组分子克隆与基因表达技术，发现了包含 - 序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较包含 - 的相对要强；而且 - 的核苷酸序列结构能与来源于人脑神经母细胞瘤的-细胞系核蛋白中的转录调节因子结合；提示基因核心启动子应该在扩增的 大小的片段内， - 可能是启动子区有功能位点突变，而包含 - 的核苷酸序列结构可能通过与包括在内的转录调节因子的作用来实现对基因表达差异的调控。    杨眉

14、等研究认为，基因启动子很可能位于翻译起始位点上游-处，与本研究的位点不同。笔者认为，由于受质粒构建以及存在组织表达差异的影响，仅从启动子区截断片段对报告基因表达强度的差异而不验证其在转录水平与转录调控因子作用的大小，是不能真正说明其是否为有功能的启动子核心片段的。等对基因启动子区位于- 和   - 两个的研究表明与家族性及其发病年龄均无相关性。笔者认为，是发病关键因素分泌酶的重要组件之一，基因启动子区单核苷酸多态性从一定程度上说明了发病多基因遗传的复杂性，提示我们今后的研究工作应多着眼于分子转录水平的功能表达以及蛋白的结构功能上，而不仅仅是研究基因的结构差异。 （感谢香港大学医学院基因研究中心宋又强博士在分子克隆及生物信息学领域的技术支持与帮助）【参考文献】  杨志勇，汪华侨，张 革，等 国人外周血抗?茁-淀粉样蛋白抗体水平的依龄性变化 中山大学学报：医学科学版， ，（）：-陈 辉，张太松，范海虹，等 阿尔茨海默病患者外周血 水平的变化 中华神经医学杂志， ，（）：-， ， ， ， ，（-）：- ， ，