三磷酸腺苷检测方法综述

1、三磷酸腺苷检测方法综述三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)是一切生物体新陈代谢的能量源泉，普遍存在于一切生物细胞体内，为细胞内各种需能过程提供能量，是细胞生存的必须因素。三磷酸腺苷(AdenosinetriphosPhate)简称ATP，又名腺三磷，腺嗓吟配糖三磷酸，分子式为C10H16N5Ol3P3，分子量为507.21。ATP是核苷酸，一分子ATP中含有一分子腺嚓吟碱基，一分子核糖和三分子磷酸基。ATP是白色无定形粉末，无臭无味。具有引湿性，易溶于水，不溶于醇、醚及其它有机溶剂。ATP在水溶液中呈微酸性，其中性钠、钾盐在-15保存，可稳定数月，在0保

2、存可稳定一星期；在0，7%的三氯乙酸中，ATP可稳定数小时；在100lmol/L盐酸中，10分钟就游离出66%的磷；在0以上的碱性溶液中ATP分解成为无机焦磷酸盐及一磷酸腺苷。中国专利CN104297219A提供一种高灵敏度的三磷酸腺苷检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：制备氨基化磁性纳米粒子；制备固定化三磷酸腺苷检测酶系统；对配置好的三磷酸腺苷检测酶系统进行预处理，清除酶系统中残留的三磷酸腺苷；使用MPI-B化学发光检测仪进行三磷酸腺苷测定。同时，通过查阅文献，我们找到了这几种方法，根据ATP与其所含杂质理化性质的差异，发展起来了许多ATP的分析方法，归纳起来主要有层析法、电泳法和光学分析

3、法。关于层析法又分为纸层析法、薄层层析法、离子交换柱层析法和高效液相色谱法。纸层析方法测定ATP含量是生化试剂核苷酸含量测定的通用方法，其常用的展开剂组成为异丙醇+浓氨水+水(7:1:2)。薄层层析法与纸层析法一样，是生化试剂核苷酸含量测定的通用方法。离子交换柱层析法是通过调节pH使核苷酸带负电，阴离子树脂吸附，通过改变PH值或降低阴离子浓度将核苷酸分离出来。高效液相色谱具有强大的分离能力，随着高效液相色谱法(HPLC)的广泛应用，ATP制剂及生物组织中ATP纯度与含量的测定变得简便易行。近年来，报道的ATP电泳分析方法主要有纸电泳法、醋酸纤维薄膜电泳法、琼脂糖凝胶电泳法和毛细管电泳法。卫生部

4、及地方的ATP标准测定方法均采用纸电泳法。该方法采用纸电泳将ATP与杂质分离，紫外分光光度计测定分离出的ATP的吸收值，计算其含量。醋酸纤维薄膜电泳法采用了与纸电泳类似的实验路线。琼脂糖凝胶电泳法可以快速测定ATP的含量。采用毛细管的区带电泳技术，克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散问题，使分析灵敏度有了很大提高，分离效率可达数百万块塔板数。光学分析法也有着其独到的优势，主要有ATP试剂盒法和生物发光法，ATP试剂盒法是运用试剂盒检测ATP的含量，生物发光法是运用荧光素酶和Mg2+的作用下，经过一些列处理发出光，根据发光强度来确定ATP的含量。检测方法方法名称操作特点专利方法CN1042972

5、19A制备氨基化磁性纳米粒子；制备固定化三磷酸腺苷检测酶系统；清除酶系统中残留的三磷酸腺苷；使用MPI-B化学发光检测仪进行三磷酸腺苷测定。利用纳米技术去除试剂本底残存的ATP（三磷酸腺苷），降低试剂本身的发光值，从而提高试剂的检测灵敏度。层析法纸层析法点样量50ug，在30cm长新华一号滤纸上层析1216小时。层析毕，50烘干，于紫外光下划斑点，对照标准，剪下ATP层析斑点(画点要同样大小)。分别将层析斑点用0.0lmol/L HCl15ml，40-50洗脱2小时，测定A260，据此算出ATP含量。对于一些定性分析，也可以直接用显色剂显色观察结果。技术成熟，操作简便，操作时间长，精度低。薄层

6、层析法以正丁醇十丙酮+冰乙酸+5%氨水+水(7:5:3:3:2)为展开剂，点样量20ug，在以硅胶GF为吸附剂的薄板上展层。层析完毕后，于50干燥，紫外光下观察吸收斑点。技术成熟，操作简便，精度低。离子交换柱层析法PH值高于5时，所有的核苷酸都会带负电荷，会被阴离子树脂吸附，因此可以采用分步降低PH值或分步增加阴离子浓度的方法将不同的核苷酸依次洗脱下来。检测洗脱液彻60，将之与洗脱液体积作图，便能得到ATP的分析结果。可大量制取ATP，操作时间长，精度低高效液相色谱法采用UV-HPLC法检测了ATP操作简单，结果准确，仪器昂贵。电泳法纸电泳法以0.05mol/L，pH3.0的柠檬酸溶液作缓冲液

7、，处理过的新华二号滤纸为支持介质，湿法点样，电压梯度1820v/cm，电泳1小时45分钟。电泳毕，吹干滤纸，于紫外灯照射下剪出各吸收斑点，在0.01mol/LHcl溶液浸泡1小时，过滤，测定上清液A257，按照吸收系数计算出ATP含量。技术成熟，操作繁琐，耗时长。醋酸纤维薄膜电泳法通过电泳、干燥、描斑点、洗脱、测吸光度值等步骤来测定ATP的含量，程序繁杂。电泳时间短，检测便捷，需薄层扫描仪。琼脂糖凝胶电泳法以琼脂糖做支持介质，以0.05mol/L、pH3.5的柠檬酸溶液做缓冲溶液，在40V/cm电压梯度下电泳5分钟，实现了ATP与其它杂质的有效分离，测得了ATP含量。电泳时间短，精度低。毛细管电泳法在Beelaman5010型毛细管电泳仪上，采用熔融石英毛细管柱，以0.025m。比磷酸氢二钠为电极缓冲液(用lmol氢氧化钠溶液调pH值至10.2