三唑席夫碱、有机爪四羧酸铜配合物抑制PTPs研究报告

1、.三唑席夫碱、“有机爪”四羧酸铜配合物抑制PTPs研究【摘要】：蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)与蛋白酪氨酸激酶(PTKs)一起调节体内的去磷酸化和磷酸化过程,在生物体内细胞信号转导过程中起到重要作用。如果蛋白酪氨酸磷酸酶功能出现异常,就有可能导致疾病的发生,如癌症、阿尔茨海默病、免疫缺陷症和糖尿病等。研究表明,通过抑制PTPs的活性,可以提高细胞中的酪氨酸磷酸化水平,调节细胞信号转导。因此,开展对蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的研究,探索其作用机理,对研究生物体中的信号转导过程,以及对新型抗癌、抗糖尿病,治疗免疫缺陷症和阿尔茨海默病等疾病的药物研发具有重要意义。上世纪九十年代,人们就已经认识到金属钒配合

2、物对PTPs有很强的抑制作用,钒配合物的降糖活性与其对PTPs的抑制机理有关。而关于其它金属配合物抑制PTPs的研究报道很少。最近,我们在研究中发现金属铜配合物能够抑制PTPIB的活性并提出金属铜配合物可能通过抑制细胞PTPs活性而调节细胞代谢。基于此发现,并考虑到铜配合物结构可能对不同的PTPs具有不同的抑制作用,我们选择了不同结构的配体,合成、表征了它们的金属铜配合物并对其抑制五种PTPs的作用进行研究。本论文的主要研究成果如下：1.设计并成功合成两类配体及铜配合物：(1)七个水杨醛类衍生物缩三唑胺席夫碱及相应的单核铜配合物1-7,该类配合物为中性化合物,具有脂溶性特点；(2)四个“有机爪

3、”多羧酸双核铜配合物,该类配合物为阴离子结构,具有适度水溶性特点。所有配合物通过红外光谱和元素分析确定其固体组成,差热分析确定了配合物8-11的热稳定性和共晶溶剂分子及离子；X-ray晶体衍射分析给出了三唑胺席夫碱单核铜配合物(1和2)和有机爪四羧酸双核铜配合物(8和10)的晶体结构信息：二(水杨醛缩三唑席夫碱)合铜(1)和二(5-氯-水杨醛缩三唑席夫碱)合铜(2)属于三斜晶系,P-1空间群,晶胞参数a,b,c及,的分别为,8.256(2),7.7403(6)A；11.907(2),8.7315(1)A；14.242(3),15.534(2)A和104.15(3),102.878(2)。;98

4、.52(3),100.102(2)°和97.03(3),101.399(1)°；2,2,2”,2”-(5-甲基-2-羟基-1,3-苯基)-二-(亚甲基)-二(亚氨基)-四乙酸合铜(8)和2,2,2”,2”-(5-溴-2-羟基-1,3-苯基)-二-(亚甲基)-二(亚氨基)-四乙酸合铜(10)属于单斜晶系,P21/n空间群,晶胞参数a,b,c及分别为,15.247(3),14.949(1)A;10.892(2),10.539(1)A;18.678(3),15.143(1)A和127.77(1),104.55(1)°；三唑胺席夫碱单核铜配合物在甲醇中和“有机爪”四羧酸双

5、核铜配合物在水溶液中的电喷雾质谱以及电位滴定分析等方法分析了这些配合物在溶液状态下的物种分布,特别是高分辨电喷雾质谱对“有机爪”四羧酸双核铜配合物的同位素理论分析和实验图谱能很好地吻合,证明了在生理pH条件下的活性物种主要是配合物形式。2.两类铜配合物在生理pH条件下对PTPs活性具有很强的抑制作用。结果表明：水杨醛缩三唑胺席夫碱单核铜配合物对PTPs的抑制能力略强于“有机爪”四羧酸双核铜配合物。水杨醛缩三唑胺席夫碱单核铜配合物对PTP1B抑制的IC50值为0.038-0.091M,比对TCPTP和PTP-MEG2的抑制作用强约3-4倍,比对SHP-1的抑制作用强约3-9倍。双核铜配合物具有对

6、PTP1B和SHP-1几乎同等的抑制作用,IC5o值为0.15-0.32M,是对PTP-MEG2抑制作用的2倍,比TCPTP的抑制作用强约10倍。值得一提的是,这两类铜配合物都几乎不抑制SHP-2。两类铜配合物在32M时能够抑制55-85%的细胞提取物中的磷酸酶活性。酶动力学研究表明,它们是PTP1B的竞争性抑制剂。我们还通过分子模拟方法指出双核铜配合物通过氢键作用结合在PTP1B的催化活性位点。3.两类铜配合物与PTP1B作用的荧光行为研究。实验结果显示,两类铜配合物都使PTP1B的荧光发生淬灭。淬灭速率常数为1.77×1014L·mol-1·s-1(配合物1)

7、,2.05×1014L·mol-1·s-1(配合物8),均大于2.0×1010L·mol-1·s-1,表明该淬灭过程属于静态淬灭。根据荧光实验原理,计算得出铜配合物与PTP1B以1:1结合,结合常数为×106L·mol-1数量级,说明铜配合物与PTP1B结合生成的产物比较稳定。根据单核铜配合物在不同温度下与PTP1B的结合常数Ka,计算获得的热力学参数说明单核铜配合物与PTP1B之间主要以分子间的弱相互作用如X德华力、氢键、还有相互作用为主。4.利用循环伏安法探索了两类铜配合物与PTP1B作用的电化学行为。当PTP

8、1B与铜配合物作用后,铜配合物的式量电位E1/2发生负移,且相应的峰电流也降低,说明配合物与PTP1B之间发生了相互作用。5.利用循环伏安法和方波伏安法对血红蛋白/透明质酸(Hb/HA)膜电极的电化学行为进行研究,实验结果显示该膜电极在pH=7.0的磷酸缓冲溶液中的平均表观异相电子转移速率为ks=5.19s-1,其式量电位E1/2=-0.36V。紫外吸收光谱证明血红蛋白在透明质酸膜上能够保持它的原始的二级结构。这个稳定的血红蛋白/透明质酸修饰电极对过氧化氢的还原表现出催化作用。【关键词】：蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂席夫碱单核铜配合物四羧酸双核铜配合物【学位授予单位】：XX大学【学位级别】：博士【学

9、位授予年份】：2011【分类号】：O641.4【目录】：中文摘要12-15ABSTRACT15-321.1蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)概述18-241.1.1PTPs的结构特征及其催化机理18-191.1.2PTPs的分类19-241.2PTPs抑制剂的研究现状24-301.2.1有机化合物PTPs抑制剂24-271.2.2金属配合物PTPs抑制剂27-301.3研究设想30-32第二章实验原理及方法32-432.1实验仪器322.2实验材料322.3配合物的结构和溶液组成分析表征方法32-342.3.1晶体结构的测试32-332.3.2pH电位滴定33-342.4PTPs的表达与纯化34-3

10、62.5PTPs活性抑制实验36-392.6C6细胞提取物中磷酸酶的活性研究实验39-402.7PTPs与配合物作用的荧光光谱研究40-422.8PTPs与配合物的电化学作用研究42-43第三章水杨醛及其衍生物缩三唑席夫碱铜配合物的合成、表征和PTPs活性抑制研究43-793.1前言433.2配体及配合物的合成与表征43-503.2.1水杨醛及其衍生物缩三唑席夫碱配体(HL(1-3)的合成与表征43-463.2.2二(水杨醛及其衍生物缩三唑席夫碱)合铜配合物1-7的合成与表征46-503.3结果与讨论50-773.3.13-氯-水杨醛缩三唑席夫碱(HL2)和3-溴-水杨醛缩三唑席夫碱(HL3)

11、的晶体结构及分子间相互作用分析50-553.3.2配合物1-7的性质研究55-773.3.2.1二(水杨醛缩三唑席夫碱)合铜(1)和二(5-氯-水杨醛缩三唑席夫碱)合铜(2)的晶体结构55-603.3.2.2红外光谱分析603.3.2.3电喷雾质谱分析60-633.3.2.4pH电位滴定分析63-643.3.2.5配合物稳定性分析64-693.3.2.5.1配体HL1在溶液中的荧光特性64-683.3.2.5.2配合物1在溶液中的稳定性68-693.3.2.6配合物对PTPs的抑制作用研究69-733.3.2.6.1配合物抑制PTPs活性的IC_(50)值的测定69-713.3.2.6.2水杨

12、醛缩三唑席夫碱合铜(1a)和3-氯-5-羟甲基-水杨醛缩三唑席夫碱合铜(6a)对PTP1B抑制类型及抑制常数K_i的测定71-733.3.2.7水杨醛及其衍生物缩三唑席夫碱合铜配合物1a-7a对C6细胞提取物中磷酸酶的抑制作用研究733.3.2.8配合物1a和6a对PTPs的荧光作用研究73-763.3.2.9配合物与PTPs相互作用的电化学研究76-773.4总结77-79第四章”有机爪”四羧酸双核铜配合物的合成、表征及PTPs活性抑制研究79-1074.1前言794.22,2,2”,2”-(5-取代-2-羟基-1,3-苯基)-二-(亚甲基)-二(亚氨基)-四乙酸合铜配合物(8-11)的合成

13、与表征79-814.3结果与讨论81-1054.3.1铜配合物8和10的晶体结构81-864.3.2红外光谱分析86-874.3.3热重分析87-894.3.4电喷雾质谱分析89-914.3.5pH电位滴定分析91-934.3.6配合物对PTPs的抑制作用研究93-954.3.6.1配合物对PTPs活性抑制作用的IC_(50)值的测定93-944.3.6.2配合物8-10对PTP1B抑制类型及抑制常数K_i的测定94-954.3.7配合物对细胞提取物中磷酸酶的抑制作用研究95-964.3.8配合物对PTPs的荧光淬灭作用研究96-994.3.9配合物与PTPs的电化学作用研究99-1014.3

14、.10配合物8的磁性研究101-1024.3.11配合物与PTP1B抑制作用机理的推测及分子模拟研究102-1054.4结论105-107第五章血红蛋白在透明质酸修饰石墨电极上的电化学行为研究107-1195.1前言107-1085.2膜电极的分类及制备108-1095.2.1涂布型膜(CastFilm)1085.2.2Langmuir-Blodgett(LB)膜1085.2.3Selfassembling(SA)膜1085.2.4层层组装薄膜(Layer-by-layer)108-1095.3血红蛋白的结构和功能109-1105.4透明质酸110-1115.5血红蛋白在透明质酸膜电极上的电化学行为研究111-1175.5.1试剂1115.5.2膜电极的制备1115.5.3仪器与实验方法111-1125.5.4