PCR与电泳步骤和注意事项参考模板

1、一， 组织分拣，每个待使用的EP管中仅保留一块组织即可，多余组织予以剔除，采用移液器枪头。二， 使用DNA-away擦拭操作台及离心机处，（操作台旁放置黄色口袋以放置废弃物）三， 组织预处理：（1）稀释碱裂解液： 采用1ml枪吸取5ml碱裂解液至试管，并加入45ml灭菌水（使得碱裂解液由10x变为1x）。 （2）使用200ul枪吸取75ul碱裂解液至组织试管中。(枪头不接触EP管前提下，可反复使用) （3）将组织试管轻轻甩动，使得组织浸泡于液体中，进行离心12k,1min (4) 将样本试管置于95摄氏度下水浴20分钟（试管上方可放置多孔板压住，以防液体压力过大喷溅出来）。 （5）充分冷却（可

2、置于4°冷室）后继续离心12k,1min （6）离心后每份标本中加入75ul Tris-hcl(震荡混匀，箱子里的仪器) (枪头不接触EP管前提下，可反复使用) （7）再次离心5分钟。四，PCR:（1） 将引物，与其他试剂管手握加热。（2） 配置20ul反应体系（按照实验报告指南选取试剂和剂量，标本数*20ul=总剂量 加完后弹拨混匀）（3） 取出数个+1个（加2ul Grade water做阴性对照）（注意是倒出而非抓取。）小PCR用EP管，每管中加入18ul反应体系液体(枪头不接触EP管前提下，可反复使用)，又加入2ulDNA样本（添加DNA样本时均使用新的枪头，应将枪头沉入PC

3、R管中再放出液体）。（不需要混匀）用毕后关闭离心机，枪等回归最大刻度。（4） 反复核对顺序，并使用MARK笔标出序号。将样本置于PCR仪中，开机，顺时针拧紧旋钮。LOGIN-PROGRAM- 电泳一，配胶（一块胶约150ml（2.1g琼脂糖），半块胶约50ml，1.5%琼脂糖（1.05g）+buffer液约70ml）在使用前先对锥形瓶进行清洗（刷子反复刷洗。瓶底若有胶块可反复使用微波炉加热）以下步骤均注意EB区手套的穿戴（1） 将称好的1.05g/2.1琼脂糖粉末倒入锥形瓶，后加入70ml/150buffer。静置一会后，同时组装机器，（注意底板的安装）（2） 电泳液反复清洗组件（放置胶区）（

4、3） 将锥形瓶中的胶体混悬液在微波炉高火下加热0.-1min,取出摇匀反复进行此步，直到液体变澄清，倒入机器。（4） 向胶体区添加EB（溴化乙锭）8ul（注意整块胶则为16Ul）。并用枪头将其混匀。并加入25孔梳子（注意梳子的孔数，整块胶则需加入两块梳子静置半小时，等待其凝固）（5） DNA Loading：向样本EP管中添加DNA LOADING BUFFER（2 / 3盖头上标记D的EP管，蓝紫色，目的是增加sample比重）4ul（吸打刮动作，使用枪头将缓冲液置于EP管边缘，盖上盖子后，通过拍打持板手的虎口，使缓冲液进入样本）后通过漩涡混合器混合（盖子压住，震荡混合）。（6） Load sample：将梳子取下，胶块置于电泳仪中（注意电极正负及是否对齐）。第一胶体孔预留给Marker（Gene ruler 8ul），吸取8ul样本置于胶体孔中