胶体金,显微镜,单个核细胞

1、胶体金 - 概述胶体金（colloidal gold），又称金溶胶（gold solution），是指分散相粒子直径在l150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。胶体金可以作为标记物用于免疫组织化学，近10多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视。胶体金 - 结构胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负

2、离子（AuC12），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。胶体金 - 特征性质胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶胶体金、加强其稳定性的作用。呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（25nm）是橙色的，中

3、等大小的胶体金（1020nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（3080nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（max）在510550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的max偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的max则偏于短波长。胶体金 - 鉴定和保存胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫

4、描max来估计金颗粒的粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径；良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。胶体金 - 发展简史胶体金标记技术胶体金作为标记物用于免疫组织化学始于1971年,Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门氏菌,此后他们把胶体金与

5、多种蛋白质结合.1974年Romano等将胶体金标记在第二抗体（马抗人IgG）上，建立了间接免疫胶体金染色法。1978年geoghega发现了胶体金标记物在光镜水平的应用。胶体金在免疫化学中的这种应用，又被称为免疫金之后，许多学者进一步证实胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肤、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位,也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位，因而在临床诊断及药物检测等方面的应用已受到广泛的重视目前电镜水平的免疫金染色(IGS)，光镜水平的免疫金银染色(IGSS)，以及肉眼水平的斑点免疫金染色技术日

6、益成为科学研究和临床诊断的有力工具胶体性质胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。近10多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视。胶体金 - 制备方法氯金酸（HauC14）是主要还原材料，通过各种方法进行还原制备金溶胶，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm150nm不等的胶体金。常见的制备方法有一下几种：1、紫外光引发还原可制备金溶胶 其还原过程经历了自由基机理

7、。用紫外可见光谱观察了不同反应时间溶胶状态的变化。结果表明，光照反应2h时明显出现金溶胶粒子，7h后氯金酸基本转化完毕。 同时,研究了稳定剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的加入对还原过程的影响,结果表明,PVP的加入不仅稳定了溶胶,而且降低了反应速率.用SEM观察了溶胶粒子聚集体的形貌.最后以1,4-bis(4-vinylpyridyl)phenylene为探针分子研究了这种溶胶的SERS活性. 2、纳米金溶胶制备以水为分散介质,PVP为分散剂,抗坏血酸作还原剂,用较高浓度的氯金酸溶液,在弱酸性条件下,通过化学还原法制得球状、最大粒径为20nm的金溶胶 结果表明,还原剂用量为抗坏血酸/Au(摩尔比)

8、=3,PVP的用量取PVP/HAuCl4(质量比)=1,还原体系自身pH值35,常温293K为金溶胶制备的最佳条件.在此条件下制得的金粉粒度小,分散性好,且十分稳定,无反溶现象. 3、磷钼酸作为光催化还原剂制备纳米金溶胶由于DMF与磷钼杂多阴离子间的电荷转移作用,导致钼系杂多酸可成为制备纳米金溶胶的光催化还原剂. 实验结果表明,紫外光照作用及光照时间、DMF用量等是影响纳米金的形成和形貌的主要因素,选择适宜的合成条件可以得到粒径均匀、分散性好的纳米金溶胶. 4、超短脉冲激光诱导制备金溶胶的方法其制法为以氯金酸浓度在05mmol/L范围内的水溶液作为反应溶液，调节可见/近红外超短脉冲激光光束并聚

9、焦，利用焦点附近的光束辐照氯金酸水溶液来制备金溶胶。本发明的制备方法工艺和装置简单，无需还原剂的引入，制备的金溶胶浓度高，稳定性好，杂质含量非常低，可用作高级非线性光学薄膜的前驱体，催化材料，也可用作食品、饮料及化妆品的添加剂。 6、一种采用激光轰击固液界面连续制备纯净金溶胶本发明系采用聚焦脉冲激光束在适当气体保护下轰击浸于连续流动液相中的，不断相对移位的金靶表面，在固液界面产生高温高压微区而生成纯净的金溶胶流出反应器。本发明方法可连续制备纯净的金溶胶，不含过量还原剂及其反应副产物、保护剂、分散剂等有害杂质，无须提纯，作为添加剂可直接应用于微电子器件、超大规模集成芯片、医学、免疫标记以及食品、

10、饮料、饮用水、酒类、化妆品等行业。胶体金 - 应用、胶体金在电镜水平的应用  胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为315nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。315nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。  胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。单层培养中细胞内抗原的检测。组织抗原的检测。  金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、

11、双标记技术和原位杂交技术等。  实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。  、胶体金在光镜水平的应用  胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。检测培养的单层细胞胞内抗原，组织中或亚薄切片中抗原的检测。  胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。  、胶体金在流式细胞仪中的应用：&#

12、160; 应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。  、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。  、免疫印迹

13、技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、）进行定量。  免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。  利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。  由于胶体金免疫印迹技术简便

14、、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。  、胶体金在肉眼水平的应用  胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：试剂和样本用量极小，样本量可低至12ul；不需计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； 没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；实验结果可以长期保存；时间大大缩短，提高了检测速度。金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELI

15、SA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。1胶体金 - 注意事项1、氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 2、氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 3、用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 4、是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 5、胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有

16、无凝集颗粒等。 胶体金 - 影响因素影响胶体金溶液稳定性的主要原因是：1、胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。2、水化层的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。3、胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。胶体金 - 应用、胶体金在电镜水平的应用。胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应

17、用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为315nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。315nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。单层培养中细胞内抗原的检测。组织抗原的检测。金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。、胶体金在光镜水平的应用。胶体金同样可用做光镜水平

18、的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。检测培养的单层细胞胞内抗原，组织中或亚薄切片中抗原的检测。 胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。 胶体金标记、胶体金在流式细胞仪中的应用。应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，

19、因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。 、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。 、免疫印迹技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、）进行定量。免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据

20、膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。 利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。 、胶体金在肉眼水平的应用。胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：试剂和样本用量极小，样本量可低至12ul；不需计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； 没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；实验结果可以长期保存；时

21、间大大缩短，提高了检测速度。金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。显微镜的种类及其使用方法 一、 光学显微镜 光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。普通光学显微镜通常能将物体放大15002000倍(最大的分辨力为0.2m)。 （一）光学显微镜的基本结构（附图-1） 1光学部分 包括目镜、物镜、聚光器和光源等。 （1）目镜 通常由两组透镜组

22、成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。在目镜上方刻有放大倍数，如10×、20×等。按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。另有照相目镜(NFK)可用于拍摄。 （2）物镜 由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：低倍物镜：指1×6×；中倍物镜：指6×25×；高倍物镜：指25&#

23、215;63×；油浸物镜：指90×100×。其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。其他物镜则直接使用。观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。 显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 （3）聚光器 由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。使用时应根据观察目的，配合光源

24、强度加以调节，得到最佳成像效果。 （4）光源 较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成。不用聚光器或光线较强时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用；用聚光器或光较弱时，一般都用平面镜。 新近出产的显微镜一般直接在镜座上安装光源，并有电流调节螺旋，用于调节光照强度。光源类型有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。 显微镜的光源照明方法分为两种：透射型与反射(落射)型。前者是指光源由下而上通过透明的镜检对象；反射型显微镜则是以物镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。 2. 机械部分 包括镜座、镜柱、镜壁、

25、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺旋等。 （1）镜座 基座部分，用于支持整台显微镜的平稳。 （2）镜柱 镜座与镜臂之间的直立短柱，起连接和支持的作用。 （3）镜臂 显微镜后方的弓形部分，是移动显微镜时握持的部位。有的显微镜在镜臂与镜柱之间有一活动的倾斜关节，可调节镜筒向后倾斜的角度，便于观察。 （4）镜筒 安装在镜臂先端的圆筒状结构，上连目镜，下连接物镜转换器。显微镜的国际标准筒长为160 mm，此数字标在物镜的外壳上。 （5）物镜转换器 镜筒下端的可自由旋转的圆盘，用于安装物镜。观察时通过转动转换器来调换不同倍数的物镜。 （6）载物台 镜筒下方的平台，中央有一圆形的通光孔。用于放置载玻片。载物

26、台上装有固定标本的弹簧夹，一侧有推进器，可移动标本的位置。有些推动器上还附有刻度，可直接计算标本移动的距离以及确定标本的位置。 （7）准焦螺旋 装在镜臂或镜柱上的大小两种螺旋，转动时可使镜筒或载物台上下移动，从而调节成像系统的焦距。大的称为粗准焦螺旋，每转动一圈，镜筒升降10mm；小的为细准焦螺旋，转动一圈可使镜筒仅升降0.1mm。一般在低倍镜下观察物体时，以粗准焦螺旋迅速调节物像，使之位于视野中。在此基础上，或在使用高倍镜时，用细准焦螺旋微调。必须注意，一般显微镜装有左右两套准焦螺旋，作用相同，但切勿两手同时转动两侧的螺旋，防止因双手力量不均产生扭力，导致螺旋滑丝。 （二）普通光学显微镜的基

27、本成像原理 光线（反光镜）遮光器通光孔镜检样品（透明）物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）镜筒目镜（再次放大成虚像）眼。 （三）普通光学显微镜的使用过程 1镜检前的准备 室内应清洁而干燥，实验台台面水平，稳固无震动，显微镜附近不应放置腐蚀性的试剂。 从显微镜柜或镜箱内取出显微镜时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地取出，放置在实验台桌面上，置于操作者左前方，距实验台边缘约10cm，镜臂朝自己，镜筒朝前。实验台右侧放绘图用具。 2调节光源 如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的灯光。直射的太阳光会对观察者的眼睛造成伤害。 转动转换器，使低倍镜正对通光孔，将聚光器上的虹彩光圈开到最大，观察

28、目镜中视野亮度，同时调节反光镜角度，使光照达到最明亮最均匀。 自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照的强弱。 3装置待检玻片 将待观察的样品制作成临时或永久装片，放在载物台上，用弹簧夹固定，有盖玻片的一面朝上。移动推进器，调节待检样品至通光孔的中心。 4低倍镜观察 将低倍镜对准通光孔，缓缓转动粗准焦螺旋，将物镜与装片的距离调至最近。注意不要压碎盖玻片。通过目镜观察，同时用粗准焦螺旋缓慢调节，直至物像出现，再用细准焦螺旋微调，同时调节光源亮度与虹彩光圈的大小，使物像达到最清晰的程度。并利用推进器把需要进一步放大观察的部分移至视野中央。 如果使用双筒目镜，应在观察前先调整双筒距离，使两眼视

29、场合并。 5高倍镜观察 转动转换器，选择较高倍数的物镜，用细准焦螺旋调节焦距，到物像清晰为止。 6油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2 mm以内，且一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时，调焦速度必须放慢，避免压碎玻片，并使物镜受损。 （1）在低倍镜下找到观察目标，中、高倍镜下逐步放大，将待观察部位置于视野中央，调节光源和虹彩光圈，使通过聚光器的光亮达到最大。 （2）转动粗准焦螺旋，将镜筒上旋（或将载物台下降）约2 cm，加一小滴香柏油于玻片的镜检部位上。 （3）将粗准焦螺旋缓缓转回，同时注意从侧面观察，直至油镜浸入油滴

30、，镜头几乎与标本接触。 （4）从目镜中观察，用细准焦螺旋微调，直至物象清晰。 （5）镜检结束后，将镜头旋离玻片，立即清洁镜头。一般先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油滴。再用擦镜纸蘸少许乙醚-酒精混合液（2：3），擦去残留油迹，最后再用干净的擦镜纸擦净（注意向一个方向擦拭）。 7还原显微镜 关闭内置光源并拔下电源插头，或使反光镜与聚光器垂直。旋转物镜转换器，使物镜头呈八字形位置与通光孔相对。再将镜筒与载物台距离调至最近，降下聚光器。罩上防尘罩，将显微镜放回柜内或镜箱中。 二、几种特殊的光学显微镜 （一）暗视野显微镜 暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨0.004m以上的微粒的存在

31、和运动。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这种现象即丁达尔效应。暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后，由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。操作者通过目镜观察到的，是检物体的衍射光图像（附图1-2）。 暗视野显微镜的基本使用方法如下： 1安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。 2选用强光源，一般用显微镜灯

32、照明，以防止直射光线进入物镜。 3在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。 4进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。升降聚光器，将聚光镜的焦点（图2中圆锥光束的顶点）对准待检物。 5选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。 （二）体视显微镜 体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间发 1 城cheng(神辫) 发表于 2008-2-14 10:07:42  （二）体视显微镜 体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间

33、影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为110 mm）以及连续放大观看等特点。生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图1-3）。 普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角-体视角（一般为12º-15º），因而能形成三维空间的立体图像。 体视显微镜与普通光学显微镜的使用方法相近，但更为便捷。二者的主要区别在于： 1. 体视显微镜的镜检对象可不必制作成装片。 2. 体视显微镜载物台直接固定在镜座上，并配有黑白双面板或玻璃板，操作者可根据镜检的对象和要求加以选择。 3. 体视显微镜的成像

34、是正立的，便于解剖操作。 4. 体视显微镜的物镜仅一只，其放大倍数可通过旋转调节螺旋连续调节。 （三） 荧光显微镜 荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。细胞内的荧光物质物质有两类，一类直接经紫外线照射后即可发荧光，如叶绿素等；另有一些物质本身不具这一性质，但如果以特定的荧光染料或荧光抗体染色，经紫外线照射后亦可发荧光（附图1-4）。 荧光显微镜的原理为利用一个高发光效率的点光源（如超高压汞灯），经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650或紫蓝光4200)作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各色的荧光后，再通过物镜后面的阻断(或压制)滤光片的过滤，

35、最后经由目镜的放大作用加以观察。阻断滤光片的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特定的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 荧光显微镜按照光路原理可分为两种： 1透射式荧光显微镜 较为旧式的荧光显微镜，其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。 2落射式荧光显微镜 激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(附图1-5)。光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈45º角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产

36、生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 （四）相差显微镜 相差显微镜是能将光通过物体时产生的相位差（或光程差）转变为振幅（光强度）变化的显微镜。主要用于观察活细胞、不染色的组织切片或缺少反差的染色标本。 人眼只能鉴别可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能鉴别相位的变化。而大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，仅存在相位的变化。相差显微镜基本把透

37、过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少1/4，则光程差变为1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差（见图6）。 从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜不同之处在于： 1环形光阑 具有环形开孔的光阑，安装在光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。 2相位板 相差显微镜在物镜内部增加了涂有氟化镁的相位板，作用是将直射光或衍射光的相位推迟1/4。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。

38、相位板按工作效果分为两种类型： （1）A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波叠加，振幅加大，标本结构比周围介质更加明亮，形成亮反差（或称负反差）。 （2）B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，标本结构比周围介质更加暗淡，形成暗反差（或称正反差）。 带有相板的物镜叫相差物镜，常在物镜外壳上标以“Ph”字样。 3合轴调节望远镜 相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在外壳上标有“CT”符号），用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，以便实现对直射光和衍射光的特殊处理。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，调节合轴调节望远镜的焦点，视野中会呈现两个圆环，分别是明

39、亮的环状光阑圆环与较暗的相板上共轭面圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节螺旋，使两环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后即可取下合轴调节望远镜，换回目镜。 4绿色滤光片 用于调整光源的波长。照明光线的波长不同，会引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整。 相差显微镜的使用步骤如下： 根据待检标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。 将标本玻片放到载物台上，进行光轴中心的调整。 使用合轴调节望远镜，调整环状光阑与相

40、板上的共轭面圆环完全重叠吻合后，换回目镜。在观察过程中，每次更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。 加绿色滤光片，按普通光学显微镜的操作步骤进行观察。 （五）倒置显微镜 倒置显微镜的结构和普通显微镜基本相同，只不过物镜与照明系统位置交换，前者在载物台之下，后者在载物台之上。主要用于观察培养的活细胞，需配制相差物镜。 （六）偏光显微镜 偏光显微镜可用于检测具有双折射性的物质，如染色体、胶原、纤维丝等（附图1-7）。和普通显微镜不同的是： 偏光显微镜光源前配备偏振镜（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光。 镜筒中有检偏振镜（检偏器，一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器）。

41、使用旋转载物台。 当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。 配备补偿器或相位片； 使用专用无应力物镜。 三、电子显微镜 电子显微镜是利用高速运动的电子束来代替光波的一种显微镜。光学显微镜下只能清楚地观察大于0.2 µm的结构。而小于0.2 µm的结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清这些更为细

42、微的结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。因此电子显微镜的分辨率远高于光学显微镜，目前可达0.2 nm，放大倍数可达80万倍。 电子显微镜的基本要结构包括镜筒、真空系统和电源柜三部分。镜筒主要由电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和照相机构等部件，自上而下地装配成一个柱体；真空系统包括机械真空泵、扩散泵和真空阀门三部分，并通过抽气管道与镜筒相联接；电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。 电子透镜是电子显微镜镜筒中的关键部件。现代电子显微镜大多采用电磁透

43、镜，由稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。 电子枪的作用是发射并形成速度均匀的电子束，由灯丝（阴极）、栅极和阳极（加速极）构成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。使用中加速电压的稳定度要求不低于万分之一。 电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。其中生物学研究中使用最为广泛的是透射式和扫描式电子显微镜。前者常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构；后者主要用于观察固体表面的形貌。 （一）透射式电子显微镜 透射电子显微镜（transmi

44、ssion electron microscope，TEM）的组件包括： 1. 电子枪 发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。 2. 聚光透镜 即电子透镜，将电子束聚集，可用于控制照明强度和孔径角。 3. 样品室 放置待观察的样品，并装有旋转台，用以改变试样的角度，还有装配加热、冷却等设备。 4. 物镜 为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。 5. 中间镜 为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流，可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。 6. 透射镜 为高倍的强透镜，用将二次放大后的中间像进一步放大后在荧光屏上成像。

45、7. 二级真空泵 对样品室抽真空。 8照相装置 用以记录影像。 由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50100 nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。通常用薄切片法或冷冻蚀刻法制备： （1）薄切片法 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度2050 nm，采用重金属盐染色，以增大反差。 （2）冷冻蚀刻法 亦称冰冻断裂法。将标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中冰冻后，以冷刀急速断开标本。断裂的标本升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称

46、为蚀刻。蚀刻完成后，向断面以45º角喷涂一层蒸气铂，再以90º角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，称为复膜，能显示标本蚀刻面的形态。在电镜下观察得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 （二）扫描式电子显微镜 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20世纪60年代问世，目前分辨力可达610 nm。其工作原理是由电子枪发射的精细聚焦电子束经两级聚光镜、偏转线圈和物镜射到样品上，扫描样品表面并激发出次级电子，次级电子的产生量与电子束入射角有关，即与样品的表面结构有关。次级电子经探测体收集后，由

47、闪烁器转换为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。 扫描电镜的标本在检验前，需进行固定、脱水处理，再喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 发帖IP：0.0.0.*我脱发,所以我关注脱发.我手术,所以我希望成功.我曾经失败过,所以我痛恨庸医.我将于庸医斗争到底,让庸医无处藏身.发 3 城cheng(神辫) 发表于 2008-2-14 10:37:33  发帖IP：0.0.0.*我脱发,所以我关注脱发.我手术,所以我希望成功.我曾经失败过,所以

48、我痛恨庸医.我将于庸医斗争到底,让庸医无处藏身.发 4 城cheng(神辫) 发表于 2008-2-14 10:41:26  外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯

49、有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95，淋巴细胞约占9095，细胞获得率可达80以上，其高低与室温有关，超过25时会影响细胞获得率。单核细胞新知社· 新浪微博· 人人网· 腾讯微博· 移动说客· 网易微博· 开心001· 天涯· MSN单核细胞是体积最大的白细胞。其细胞核常偏位，呈多形性，如卵圆形、肾形、马蹄形、不规则形等，常有折叠感；染色质呈疏松网状，着色较浅。胞质较多，嗜碱性，但因含大量细小的嗜天青颗粒而染成灰蓝色，颗粒

50、含过氧化物酶。· 1 概述· 2 介绍· 3 主要用途· 4 结构特点· 5 临床病例· 6 功能· 7 异常状态o 7.1 生理学变异 o 7.2 药物影响 o 7.3 病理学变异 ·单核细胞 - 概述单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育。当它们从骨髓进入血流时仍然是尚未成熟的细胞。与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性脂酶，并且具有更强的吞噬作用。单核细胞在血液中停留2-3天后迁移到周围组织中，细胞体积继续增大，直径可达50-80m，细胞内所含的溶酶体颗粒和线粒体的数目也增多，成为成熟的细胞

51、。固定在组织中的单核细胞称为组织巨噬细胞，它们经常大量存在于淋巴结、肺泡壁、骨髓、肝和脾等器官。激活了的单核细胞和组织巨噬细胞能生成并释放多种细胞毒、干扰素和白细胞介素，参与机体防卫机制，还产生一些能促进内皮细胞和平滑肌细胞生长的因子。在炎症周围单核细胞能进行细胞分裂，并包围异物。1单核细胞 - 介绍单核细胞来源于骨髓中的前体细胞，进入组织中分化为 M。成熟机体主要由骨髓不断产生单核细胞，进入血液，存留数小时至数日后，移行到全身各组织器官如神经器官、内分泌器官、肾脏、肝脏、脾脏及淋巴组织，发育成熟为M。组织器官中静息的M与趋化至炎症反应部位、主要承担杀伤作用的M相比，能存活更长时间（

52、几天至几周不等）。炎症状态下，M与其它细胞一起（尤其是中性粒细胞）从骨髓及循环系统进入损伤部位。M功能的发挥与M所表达的各种表面分子、产生的酶或分泌产物有密切关系。M表达的数十种受体，将M与其周围环境联系起来，而调节M的各种活性，如生长、分化、激活、迁移、粘附、识别、吞噬及分泌等，它们表达于M表面的特定部位，介导M内的信号转导或介导M对颗粒状物质或细胞的摄取与加工处理。因此它们在机体的防御、炎症反应、损伤修复等生理和病理过程中发挥着重要的作用。M还能产生多种胞内酶和胞外酶，如各种溶酶体酶，可销毁吞入细胞内的异物，溶菌酶能水解吞入细胞的革兰阴性菌；髓过氧化物酶能杀灭细菌。M尤其是活化的M还产生近

53、百种生物活性产物，包括多种细胞因子如IL-1、IFN-、TNF-、IFN-、TGF-等、多种补体成分如C1、C2、C3、C4、C5、B 因子、D 因子等、多种凝血因子如凝血因子IX、X、V、VII 等，此外还能产生反应性氧代谢中间产物和NO 等。这些分泌产物因M所受刺激的不同而不同，也与M活化的程度和所处的活化阶段有密切关系。M上还表达丰富的MHC I 类分子和II 类分子，这是M处理和提呈抗原所不能缺少的免疫分子。单核细胞 - 主要用途单核细胞能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治愈、抗御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作

54、用。机体发生炎症或其他疾病都可引起单核细胞总数百分比发生变化，因此检查单核细胞计数成为辅助诊断的一种重要方法。在机体的防护、免疫和创伤愈治过程中起协同作用。尽管它们是血液中的一类细胞成分，但它们功能的发挥，更多地体现在循环管道外的器官组织中。在功能方面它们与这些器官组织中的许多细胞成分如巨噬细胞、肥大细胞、成纤维细胞等密切相关。特异性免疫功能淋巴细胞也称免疫细胞，在机体特异性免疫过程中起主要作用。所谓特异性免疫，就是淋巴细胞针对某一种特异性抗原，产生与之相对应的抗体或进行局部性细胞反应，以杀灭特异性抗原。血液中淋巴细胞按其发生和功能的差异，分为T淋巴细胞和B淋巴细胞两类。（1）细胞免疫细胞免疫

55、主要是由T细胞来实现的。这种细胞在血液中占淋巴细胞总数的8090。T细胞受抗原刺激变成致敏细胞后，其免疫作用表现以下三个方面。直接接触并攻击具有特异抗原性的异物，如肿瘤细胞，异体移植细胞；分泌多种淋巴因子，破坏含有病原体的细胞或抑制病毒繁殖；B细胞与T细胞起协同作用，互相加强，来杀灭病原微生物。（2）体液免疫体疫免疫主要是通过B细胞来实现的。当此细胞受到抗原刺激变成具有免疫活性的浆细胞后，产生并分泌多种抗体，即免疫球蛋白，以针对不同的抗原。B细胞内有丰富的粗面内质网，蛋白质合成旺盛。抗体通过与相应抗原发生免疫反应，抗体能中和、沉淀、凝集或溶解抗原，以消除其对抗体的有害作用。嗜碱性和嗜酸性粒细胞的功能这两种细胞在血液中停留时间不长，主要在组织中发生作用。单核细胞（1）嗜碱性粒细胞这类细胞的颗粒内含有组织胺、肝素和过敏性慢反应物质等。肝素有抗凝血作用，组织胺可改变毛细血管的通透性。过敏性慢反应物质是一种脂类分子，能引起平滑肌收缩。机体发生过敏反应与这些物质有关。嗜碱性细胞在结缔组织和粘膜上皮内时，称肥大细胞，其结构和功能与嗜碱性细胞相似。（2）嗜酸性粒细胞这类细胞平时只占白细胞总数的3，但在患有过敏反应及寄生虫病时其数量明显增加，如感染裂体吸虫病时，嗜酸性粒细胞可达90。这类细胞吞噬细菌能力较弱，但吞