审稿专家一初审意见回答

1、审稿专家一初审意见回答1.专家意见：摘要中方法部分请简要补充实验分组情况，梳理并精炼方法中的语言回答：非常感谢您的专业建议，我们已将摘要中方法部分进行了修改。“采用MPTP（25 mg/kg）和丙磺舒（250 mg/kg）联合诱导小鼠慢性PD模型；治疗组连续饮用链霉素水溶液（500 g/ml）。通过转棒和爬杆实验观察小鼠的行为学变化，脑组织免疫组化检测黑质纹状体系统中DA能神经元数量及其纤维含量的变化，测量小肠传导率和结肠长度评估肠道功能，定量结肠上皮炎性细胞因子mRNA以及内毒素含量评估肠道的炎症状况，高通量测序分析各组肠道细菌群落结构。”已改为“将40只C57BL/6小鼠分为正常对照组、硫

2、酸链霉素对照组、帕金森病模型组和硫酸链霉素干预帕金森病模型组。帕金森病模型组在实验的前五周采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）（25 mg/kg）和丙磺舒（约100 mg/kg/d）联合诱导帕金森病模型；硫酸链霉素干预帕金森病模型组在模型构建的同时连续饮用链霉素水溶液（500 g/mL）至实验第8周末。综合运用转棒实验、爬杆实验、免疫组织化学、荧光定量PCR、高通量测序等实验方法，检测各组实验小鼠相关症状与指标。”2.专家意见：请补充相关英文缩写的全称回答：已将文章中初次出现的M

3、PTP、DA和NMS英文全称补充。3.专家意见：ml应改成mL回答：已将文章中所有的“ml”改为“mL”。4.专家意见：请将明显和显著区分清楚回答：已将文章中所有表示显著性差异的地方统一为“显著”，不再用“明显”。5.专家意见：请添加菌名的拉丁文名称回答：已将所有菌名的拉丁文名称添加，文章中（第17-18行）呈现为：厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes, F/B），普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）。6.专家意见：优化英文摘要的语言回答：已请教母语为英语的朋友将英文摘要优化。7.专家意见：所有属名格式不一致问题回答：已将文章中属名格式调一致。8.专家意

4、见：对“Clostridium XIVb属”怀有疑问回答：已将“Clostridium XIVb属”更改为“梭菌属XIVb （Clostridium XIVb）”。9.专家意见：请对“米诺环素对PD的保护作用亦可能通过肠道菌群调节发挥”这句话进行梳理回答：考虑到前后文的衔接，已将“米诺环素对PD的保护作用亦可能通过肠道菌群调节发挥”修改为“因此米诺环素对PD的保护作用亦可能与其对肠道菌群的调节相关”。10.专家意见：为何口服给药可将硫酸链霉素对宿主的全身影响的风险降至最低？回答：硫酸链霉素属于氨基糖苷类抗生素，药代动力学研究显示其口服吸收差，因此在临床上给药方式采用肌内注射。口服吸收差是指硫酸

5、链霉素口服后到小肠，小肠上皮细胞不能吸收，不能进入血液循环，不进行肝、肾代谢，故采用口服的方式可使其对全身循环代谢影响的风险降至最低，且有文献（Russell SL, Gold MJ, Reynolds LA, et al. Perinatal antibiotic-induced shifts in gut microbiota have differential effects on inflammatory lung diseases. The Journal of allergy clinical immunology, 2015, 135(1): 100-109.）中明确表述硫酸链霉

6、素该特点。11.专家意见：为什么选择硫酸链霉素？回答：近年来关于PD与肠道微生物的研究表明肠道菌群与PD的发生发展密切相关。2016年发表于Cell杂志上的一篇研究报道采用高浓度的抗生素混合物（氨苄青霉素1g/L，万古霉素0.5 g/L，新霉素0.5 g/L，庆大霉素100 mg/L，红霉素10 mg/L，自由饮用）对PD小鼠进行治疗（从5-6周龄至12-13周龄），小鼠的病情得到了缓解。该治疗主要是通过影响肠道菌群发挥作用的，但长期、高强度的抗生素治疗显然是不明智的，会导致其他免疫器官和代谢功能的紊乱。在其应用的抗生素中新霉素和庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，口服吸收差。硫酸链霉素同属氨基糖苷类

7、抗生素，在科学研究中用于干扰肠道菌群研究其他疾病，且有研究表明硫酸链霉素口服给药可将其对宿主全身影响的风险降至最低，另有报道指出链霉素水溶液（150 mg/L、300 mg/L、450 mg/L，自由饮用）处理C57BL/6小鼠2天，并没有显著改变肠道总细菌的丰度，而是导致了细菌群落结构的变化，因此在这里我们选用硫酸链霉素。为在文中更清楚地阐明为何选择硫酸链霉素，已将文章语言“硫酸链霉素（Streptomycin sulfate，STR）属氨基糖苷类抗生素，口服吸收不良，故常肌内注射，采用口服给药可将其对宿主全身影响的风险降至最低”修改为“高浓度的抗生素混合物（氨苄青霉素1g/L，万古霉素0.

8、5 g/L，新霉素0.5 g/L，庆大霉素100 mg/L，红霉素10 mg/L，自由饮用）对PD小鼠进行治疗，小鼠的病情得到了缓解。该治疗主要是通过影响肠道菌群发挥作用的，但长期、高强度的抗生素治疗显然是不明智的，会导致其他免疫器官和代谢功能的紊乱12。硫酸链霉素（Streptomycin sulfate，STR）属氨基糖苷类抗生素，口服吸收不良，故常肌内注射；利用其肠道吸收极少的特性，常被用于干扰肠道菌群而进行其它研究，如金葡菌在胃肠道定植、伤寒沙门菌对肠道的感染等。”12.专家意见：关于斟酌引言部分最后一段话语句的问题回答：谢谢您的建议，为更清楚地表达，我们已将“本研究假设连续使用硫酸链

9、霉素可干扰肠道菌群，从而改善慢性PD的胃肠道功能，减少慢性PD脑组织DA能神经元的损失以及纹状体DA能神经元神经纤维的含量，进而改善慢性PD的运动障碍。为了验证该假设，进行以下实验：采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-four hydrogen pyridine, MPTP）和丙磺舒 (probenecid, P)联合用药作用于C57BL/6成年小鼠，建立慢性PD模型14，同时自由饮用硫酸链霉素水溶液，分析硫酸链霉素干扰肠道菌群对PD小鼠的治疗效果，并探讨肠道细菌在其中的作用。”修改为“鉴于硫酸链霉素的特性以及肠道菌群与PD发生的

10、密切关系，我们考虑是否可应用硫酸链霉素调节PD小鼠的肠道菌群，从而缓解PD症状，因此进行了以下实验：采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）和丙磺舒 (probenecid, P)联合用药作用于C57BL/6成年小鼠，建立慢性PD模型，同时自由饮用硫酸链霉素水溶液（500 g/mL），分析硫酸链霉素干扰肠道菌群对PD小鼠的影响，并探讨肠道细菌在其中的作用。”13.专家意见：标题“实验分组与动物模型构建”是不是不能完全反映下面的内容？回答： 1.2中为小鼠饲喂过程中相关实验内容，小标题“

11、实验分组与动物模型构建”基本可以概括以下段落内容，为准确明了的表达实验最主要的流程，已在段落后添加了具体的流程图。14.专家意见：关于丙磺舒和MPTP的用药量问题回答：已在文章中已添加了用药量，由文章中的“丙磺舒（12.5 mg/mL）”修改为“丙磺舒（12.5 mg/mL，20 mL/kg小鼠体重）”、“MPTP（2.5 mg/mL）”修改为“MPTP（2.5 mg/mL ，10 mL/kg小鼠体重）。15.专家意见：语句“造模结束后继续饲养3周”中饲养一词引起错觉；建议加实验流程图。回答：已将“造模结束后继续饲养3周”改为“造模结束后继续饲养3周，STR和PD_STR组继续自由饮用硫酸链霉

12、素水溶液”，并增加了实验流程图（图1B），以明了造模结构后3周的饲养情况。16.专家意见：请完善样品采集时间回答：已在文章中的第133-134行添加了样品采集时间。17.专家意见：小标题表述不准确的问题回答：已将“结肠上皮细胞因子丰度的RT-PCR检测”改为“结肠上皮细胞炎性细胞因子丰度的RT-PCR检测”。18.专家意见：关于内毒素的检测是否有相关参考文献回答：关于内毒素的检测，本实验采用某三甲医院检验科的仪器设备与试剂盒，技术已经很成熟，相关参考文献有很多，如：1）张建芳,徐修礼,樊新, 等.不同疾病患者血浆内毒素含量的测定及结果分析J.临床检验杂志,2005,(6):449-450. 2

13、）廖广仁,罗宇芬,赖伟华.4种抗菌药物诱导肺炎克雷伯菌释放内毒素特性的研究.中国药房,2004,(12):744-746. DOI:10.3969/j.issn.1001-0408.2004.12.017. 3）Chen S, Wu HQ, Chen S, Yang YG. The value of quantitative determination of urine endotoxin for rapid diagnosis of urinary tract infections caused by Gram-negative bacteria. Chinese Journal of Mi

14、croecology, 2015,27(6):732-734.已将内毒素检测的参考文献加上：上述第3）个。19.专家意见：请提供引物338F/806R的序列回答：已将引物338F/806R的序列补上。文中呈现为“采用细菌16S rRNA基因 V3-V4区引物（338Fforward primer：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG ；806Rreverse primer：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对粪便DNA进行PCR扩增。”20.专家意见：请确认杂志要求是否需要提供中文图注回答：在微生物学报杂志的投稿须知行为格式里对图片的要求为：在正文中插图位置的下方写图题（中英文）及

15、图注（英文）。所以未加中文图注。21.专家意见：“PD组小鼠与CK组相比需要更多的时间去完成爬杆测试”这种表达过于含糊回答：在写作过程中确实没有表达清楚，现已纠正，在文章中已将“PD组小鼠与CK组相比需要更多的时间去完成爬杆测试”修改为“PD组小鼠完成爬杆实验所需时间较CK组长（P0.01）”。22.专家意见：在结果部分对高通量数据分析时多处缺少小标题回答：在写作过程中确实没有把大标题下的层次表述清晰明了，现已将小标题加上，文章中呈现为：2.7.1 Alpha ()多样性分析；2.7.2 Beta ()多样性分析；2.7.3物种组成分析；2.7.4 物种差异分析。23.专家意见：组间细菌群落结

16、构差异是否有显著性差异？回答：感谢您提出的专业意见。为更清楚地分析组间细菌群落结构差异，我们对原始数据进行基于OTU水平的ANOSIM分析，并将此部分内容补充至文章中的第262-263行，并将图增加为7B。ANOSIM分析结果R值为0.6837，P=0.001，表明组间细菌群落结构具有显著性差异。24.专家意见：为什么选择这三个科（Ruminococcaceae、Deferribacteraceae、Prevotellaceae）来表述？回答：因为在科水平上进行统计学分析，这三个科PD组与CK组相比差异具有统计学意义。25.专家意见：菌科相对丰度数值表达上不合理问题回答：谢谢您的建议，在写作过

17、程中将%给漏掉了，现已加上。26.专家意见：图8没有总题目回答：已将图8总题目加上，在文章中（第290行）呈现为：不同分类学水平群落结构分析。27.专家意见：关于属名用斜体的问题回答：已将文中所有属名改为斜体。28.专家意见：结果中有这样的论述：转棒试验结果如表1所示，试验第5周末PD组小鼠累积运动活性得分较CK组低（P0.05），PD_STR组较PD组无明显改善，能否说“硫酸链霉素早期应用改善了PD小鼠的运动损伤”，请斟酌。同样，如果免疫组化染色结果没有5周末的时间点，这个说法是否合适？回答：谢谢您的建议。1）因为整个过程均饮用硫酸链霉素水溶液，文中“早期”不合适，均已删掉，以使表达更加准确

18、。2）关于5周末没有免疫组化结果能否这样表达“硫酸链霉素应用改善了PD小鼠的运动损伤”的问题：首先运动障碍是否存在是通过神经行为学检测得到的，免疫组化结果则直观的呈现脑部病变，8周末免疫组化结果显示出各组间的差异，表明此模型效果一直可持续到第8周（文献表明此模型可以持续3-6个有月），因此文中“硫酸链霉素应用改善了PD小鼠的运动损伤”的说法应该没有问题。29.专家意见：请确认是否是多巴胺能神经元纤维的损伤回答：已将“同时也减少了脑组织DA能神经元和其纤维的减少”修改为“缓解了脑组织黑质部DA能神经元的丧失和纹状体中DA能神经元纤维含量的减少”。30.专家意见：“应用硫酸链霉素后慢性PD小鼠的肠

19、道功能障碍得到了一定的改善” 是否可以这么肯定？是否有相关的实验证据？回答：小肠传导率为评估肠道功能障碍的指标之一，我们根据PD小鼠小肠传导率明显的下降而得出其倡导功能障碍的结论，应该没有问题。为表述更加清晰明了，将“本研究中，慢性PD小鼠的小肠传导率和结肠长度均明显低于正常小鼠；有趣的是，PD_STR组小鼠小肠转运速率和结肠长度与正常小鼠相比均差异不显著，表明应用硫酸链霉素后慢性PD小鼠的肠道功能障碍得到了一定的改善”改为“本研究中，慢性PD小鼠表征小肠转运时间的小肠传导率明显低于正常小鼠；有趣的是，饮用硫酸链霉素的慢性PD小鼠小肠转传导率与正常小鼠相比差异不显著，表明应用硫酸链霉素后慢性P

20、D小鼠的肠道功能障碍得到了一定的改善”。31.专家意见：关于硫酸链霉素口服吸收差不建议“众所周知”这个词来表述的问题回答：已将“众所周知”改为“药代动力学研究显示”。32.专家意见：关于“我们对小鼠的粪便样品进行了高通量测序，发现慢性PD小鼠存在肠道菌群紊乱”这句话表述不当的问题回答：该句确实表述不清楚，现已将“我们对小鼠的粪便样品进行了高通量测序，发现慢性PD小鼠存在肠道菌群紊乱”修改为“本研究对小鼠粪便样品中细菌16S rRNA进行了高通量测序，发现慢性PD小鼠与健康小鼠相比肠道细菌群落组成存在显著差异”。33.专家意见：认为5周末的实验数据对抗生素的早期干预效果才可以提供一定的支持回答：

21、首先我们是根据小鼠的神经行为学测试结果初步判断硫酸链霉素干扰肠道菌群达到的预期效果，5周末神经行为学测试中的仅爬杆实验显示出硫酸链霉素的效果，在实验的第8周，转棒实验和爬杆实验结果都显示出处理间的显著差异，故我们选择8周这个时间点进行后续的实验。小鼠PD慢性模型是一个逐渐进展的过程，PD相关症状可持续3-6个月，理论上这个时间段内均可进行实验。实验过程中硫酸链霉素一直饮用，故认为8周末的实验数据亦可对抗生素的干预效果提供支持。因为整个过程均饮用硫酸链霉素溶液，文中“早期”均已删掉，以使表达更加准确。34.专家意见：讨论最好挖掘到属水平回答：讨论已经挖掘到属水平，添加了以下内容“在属的水平的LE

22、fSe分析结果显示，Ruminococcaceae_ UCG_014、Lactobacillus、Alistipes 、Akkermansia、Lachnospiraceae_UCG_001是PD组小鼠肠道中的特征性微生物群，最近研究表明在PD患者的肠道中Alistipes丰度较正常对照者显著升高5，而在本实验中该菌属不是正常小鼠和硫酸链霉素对照小鼠的特征性菌属，因此Alistipes可能参与了帕金森患者或小鼠病情的发展。肠道丁酸盐产生菌（Butyrate-producing bacteria, BPB）通常被认为是对宿主健康有益的一类微生物，BPB丰度的降低被报道与多种疾病相关，如帕金森病、炎症性肠病、结直肠癌等39-41。丁酸是肠上皮细胞所偏好的能源物种，能够调节肠道的能量代谢，