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1、原核蛋白表达（上清表达）案例原核蛋白表达（上清表达）案例1. 实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白A。2. 实验设计（1） 分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体pCzn1，构建表达质粒pCzn1-A；（3） IPTG诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至37，经分析目标蛋白主要呈可溶形式表达，通过Western Blot检测蛋白A是否表达； （4）通过上清纯化方式，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。3. 蛋白分析（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序

2、列：m.w.=10.66kd，pI=6.64（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：拟南芥（3）目的基因稀有密码子分析及蛋白结构分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pCzn1上，可用于原核表达上清表达，利用载体自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白N端添加His标签便于纯化。4. 表达载体构建4.1 pCzn1-A质粒酶切验证：钟鼎特色载体pCzn1酶切鉴定Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500Line1: 酶切前质粒Line2: 酶切后质粒基因名称：A（OD260/OD280:1.82）酶切位点：NdeI/XbaI 4.2 pCzn1-A质粒测序验证：部分序列比对结果图5.蛋白表达及纯化蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析M: 蛋白质分子质量标准1: 未诱导2: 诱导后3: 诱导破碎后上清4: 诱导破碎后沉淀 蛋白纯化SDS-PAGE分析M: 蛋白质分子质量标准1: 破碎后处理样品2: 流出3: 洗脱蛋白Western Blot鉴定分析M: 蛋白质分子质量标准1

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