论硅藻喂食对鲍鱼幼体生长和存活率的影响

1、论硅藻喂食对鲍鱼幼体生长和存活率的影响Nurit Gordon a, Amir Neori a,*, Muki Shpigel a, John Lee b, Sheenan Harpaz c摘要：检查一个月中不同硅藻的喂养对幼苗生长和皱纹盘鲍的生存。两种硅藻Amphora luciae Cholnoky和Navicula cf. lenzii Hustedt, 特别是混合投料后，能够保障幼体快速生长和高存活率。第3个品种的硅藻种类，Nitzschia laevis Hustedt, 作为单一藻类饮食，不支持超过两个星期的生存并在混合饲料价值有限。在养殖的第一周，混合藻类喂食优于单一藻类喂食，N

2、. cf. lenzii and A.lucia 的混合饲料支持最高的存活率，高达50%, 同时生长率达每天36m 壳长, 在养殖30天后到达1.4mm. 这三种藻类含有总脂含量高 (占干基重量的6.4%14.5%)与脂肪酸(占脂类的16%22%); 有39% 到 48% 的脂肪酸为多不饱和性脂肪(PUFA). 三种藻类的n-3 PUFA含量高于n-6 PUFA. 在PUFAs 类中，必需脂肪酸20:5n-3 (EPA)含量最高，在实验结果较好的两种藻类A. luciae 和 N. cf. lenzii中含量较高但不显著。在游离氨基酸类中，精氨酸主要存在于N. laevis, 脯氨酸主要存在于

3、N. cf. lenzii, 这两种氨基酸与谷氨酸主要存在于A. luciae且含量均等。A. luciae and N. cf. lenzii 能够促进幼体生长和提供幼体存活率的适配性是因为它们的互补均衡的营养成分。关键词：鲍鱼;仔虾，生化成分;生长;生存;饮食;硅藻，脂肪酸;氨基酸1、简介： 深海硅藻是在幼苗孵化场鲍鱼主要食物来源。鉴于对新定居鲍鱼幼体，营养生长和存活率的研究越来越多，如在早期的文献报道，尽管幼苗阶段数是可变的，普遍偏低。低劣的和不可预知的性能关系到食物（和不同的硅藻的组成），以及鲍鱼孵化场品种和生长条件。为了提高经济增长，并在特殊的生长系统使用特定的硅藻种类的鲍鱼幼苗阶段

4、的生存，他们的基本饮食要求，更好地了解是必要的。细胞密度，消化效率，可食性，细胞外的产品，以及相关的细菌是众所周知的影响在早期幼苗阶段食品硅藻价值。对藻细胞生化组成的另一个重要因素，但其效果已审查大多在幼鲍，而不是在新定居幼苗。 一旦幼苗获得能力来消化和利用硅藻细胞，食物是最重要的生化成分。据他们说，饮食小硅藻在定居后的头两个星期的生长率有影响。当幼苗开始消化和利用单元格内容时，饮食相关幼苗的增长率在800微米分歧。据Daume等（1999年），附着后一个星期，由不同的硅藻喂养的幼苗已经可以很早的观测到生长率的差异。有关利用微藻作为饲料营养价值的影响在很大程度上受他们的脂质脂肪酸组成，并通过较

5、小的程度上糖组成。微藻的蛋白质氨基酸组成一般是固定的（Brown等。，1996），是不大可能在一个特定物种的营养价值的主要差异的形式。游离的氨基酸（FAA）可能构成对藻细胞的氨基酸总量相当大的比例和其组成藻类也各不相同。事实表明尤其是在早期生命阶段，在肠道酶参加蛋白质消化前，FAA是很容易被幼苗吸收的。基于这个原因，在FAA中硅藻的组成和脂肪酸是目前研究的重点。硅藻作为一个分类，提供高层次的脂类和多不饱和脂肪酸，尤其的是多不饱和脂肪酸20:5（n-3），因此可满足鲍鱼幼苗营养要求比用其它藻好。多不饱和脂肪酸(PUFA)中的n-3和n-6是皱纹盘幼鲍生长必不可少的。它们的主要功能被认为是结构性的

6、。其中多不饱和脂肪酸20:5（n - 3），似乎最有助于加快皱纹盘幼鲍生长。本研究的目的是调查皱纹盘鲍幼苗在喂养不同的硅藻（包括本地种）时的增长和存活率，其中已经被证明诱导幼虫附着，并确认了这些是否与硅藻的营养品质有关。2、材料与方法2.1 鲍鱼幼苗的制备实验所用的皱纹盘鲍幼虫从埃拉特室内鲍鱼育苗场取来（红海，以色列）。用紫外线诱导幼虫产卵。收集受精卵到20-L的养鱼池中，浓度为12颗卵每毫升。为控制细菌生长，加入抗生素1.5毫克每升。幼虫保持在22，光暗周期比12L12D（光照强度为60-70mol m-2s-1）4至5天，直到合格。在第5天，通过观察游泳行为对幼虫的能力进行评估，如Seki

7、 and Taniguchi（1996）描述的。合格的幼虫用于生长实验。2.2 硅藻的人工培育深海硅藻是从红海（Eilat，以色列）和大西洋（马萨诸塞州，美国）分离出的（见表一）。制备无菌培养物如Gordon等所描述（2004）。把硅藻培养1L的锥形瓶中，里面装满f/2培养基,且富含二氧化硅（硅酸钠）和二氧化碳。在整个生长实验中温度保持在22，光照强度为60-70mol。2.3鲍鱼幼苗生长实验把合格的大小为280±12m的幼虫转移到90mm大小的培养皿中，加入32%的红海海水。为了减少处理损坏幼虫，取样的数量要根据培养瓶中样品的多少。每个培养皿中放入82±17大小的幼虫。向

8、培养基中加入1M的-氨基丁酸（GABA）的（Morse，1992年）和50毫克/升（每个）青霉素，链霉素（Sigma）（Morse和Morse，1984年）诱导幼虫附着。这种方法优于自然附着的硅藻，在硅藻的处理中幼虫的附着取得了较好的重现性。24小时后，从海藻跟碟状物中洗出氨基丁酸加入（见表1）。5个相同的培养皿中分别加入藻种。藻细胞浓度调整为获得相同的细胞体积，而不是在实验中所有细胞的数目。培养基中的水每天换一次，每个星期换次新鲜的藻。在这周内每个培养基中投藻，保持幼苗的补给直到出现清晰的斑点。在开始实验的时候，通过加入培养基中的幼苗百分比测定幼虫的存活率。每周用目镜测微尺测量所有幼苗的壳长

9、(SL)取平均值。通过计算公式计算每天的生长比率，Lf-Li/t，Lf=最后的壳长（微米），Li=初始壳长，t=用时。每次实验时间为31天。2.4藻细胞的生化分析把三个藻种（Nitzschia laevis, Amphora luciae andNavicula cf. lenzii）在对数生长后期阶段的时候进行收成，对其脂肪酸进行分析。对冻干藻细胞进行离心浓缩和脂质提取（Folch等，1957）。从脂肪酸甲酯中提取脂质提取物，在50含2%硫酸的甲醇中一夜，进行酸化甲基化。由此产生的FAME进行浓缩并注入Chrompack CP9001气象色谱仪中（Koven等，2001）。对3种硅藻处在对数

10、生长期后期的细胞进行离心，用超声波对细胞进行均质5分钟，对游离的氨基酸进行分析。对细胞进行精确的破碎。根据Moor和Stein缩描述（1951）的用高效液相色谱仪（Biotronik的LC - 5000氨基酸分析仪）对游离的氨基酸进行分析。物质放在105下24小时后，物质的质量为干质量。粗蛋白的含量为凯氏定氮法乘以6.25.粗脂质的测定把样品放在氯仿甲醇（2:1）溶液中均质5分钟后，通过重量分析测量得（Folch等，1957）。样品在马弗炉中550下24小时后的质量为灰分含量。碳水化合物的计算公式为：碳水化合物=干物（粗蛋白质+脂肪+灰）。2.5统计分析采用方差分析（单向）与邓肯的多个范围的测

11、试，对这些数据进行了比较。结果，用百分比表示圆弧正弦变换前方差分析均质差异（(Sokal and Rohlf, 1969)。3、结果3.1鲍鱼幼苗的存活第一个月幼虫或幼苗的存活率（表2），喂养N. laevis（投料2）只有4%，喂养N. cf. lenzii and A. luciae（投料6）高达49%。喂养N. laevis的幼苗存活率明显比其他组投料的低（P0.05），以后的数据分析要排除这些幼苗。3.2鲍鱼幼苗的生长除了喂养N. laevis幼苗出现异常，其他组的投料都能使幼苗稳步增长。生长最快的是喂养N. cf. lenzii和A. luciae（投料6）和3种硅藻混合的（投料4）

12、。经过1个月的生长，幼苗的壳长平均分别的达到1.4毫米和1.3毫米（图1）。这样处理的增长率明显比其他投料的要高（P0.05）。用A. luciae和N. cf. lenzii喂养的幼苗每天平均增长35.5 ± 1.1微米，用3中混合的藻喂养每天平均增长33.2 ± 2微米。.在头12天，喂养A. luciae和N.laevis（投料7）混合藻的比其他投料的要生在的快（表2）。在前2周，投料7幼苗保持着最大（P0.05）壳长（图1）。然而后来，投料4和投料6幼苗的壳长的增长有明显的变好，而投料7的幼苗在第24天到31天有所变坏（图1）。在第一周后，投料单藻N. laevis

13、（投料2）的幼苗长的最差（图1）。单独投料A.luciae（饮食3）是最好的单硅藻投料，但显着（P b0.05）低于所有混合硅藻饮食。3.3硅藻中脂肪含量的组成 硅藻通过分析脂类占6.4之间和14.5的干重（见表3）。多不饱和脂肪酸（PUFA）是总脂肪酸(TFA)最大的组成成分（占41到47）。硅藻种间各不饱和脂肪酸的比例不同。虽然所有的硅藻分析大多数（14%到21%的TFA）是20:5n-3 (EPA)，N. laevis有这少比例的这种脂肪酸还有大量的（9.7%的TFA）20:4n-6花生四烯酸(AA)。短链不饱和脂肪酸16:2n-4和16:3n-4也是大量（4.2到8.5的TFA）存在于

14、三种硅藻中（表4）。3.4硅藻中氨基酸含量的组成这三种硅藻总的游离氨基酸（TFAA）组成不同（表5）。在N. cf. lenzii中脯氨酸是主要的游离氨基酸（2.8 fmol每细胞，49%TFAA）但只要较少的成分（0.13 fmol每细胞，8%TFAA）在N. laevis.中。A. luciae中脯氨酸含量中等（0.8fmol每细胞，30%TFAA）。在所有分析的物种中，精氨酸的含量比脯氨酸的还多。In N. laevis中精氨酸是组要的游离氨基酸（0.7 fmol每细胞，43%TFAA），in N. cf中只有0.18 fmol每细胞（3%TFAA）。A.luciae中精氨酸含量居中（1

15、.5 fmol每细胞。22%TFAA）。在in N. laevis中谷氨酸含量跟其他二种藻相比是最少的，但是in N. laevis中发现了其他二种藻没有的谷氨酰胺。in N. cf. lenzii 和A. luciae中蛋白质含量是相同的（32%DW），in N. laevis要高一点（38%DW）(表3)。碳水化合物的含量在in N. laevis中（18）最低，N. cf. lenzii中最高（25）。灰分含量在A.luciae（41）最高。4、讨论4.1鲍鱼幼苗的生长和存活皱纹盘鲍幼苗喂养不同硅藻的生长的实验，再加上这些硅藻生化分析，建立了这些硅藻有助于幼苗附着通常也就有助于幼苗的生长

16、于生存。在我们以前的研究中（Gordonet等，2004），我们发现在这个研究中N. laevis,，N. cf. lenzii和A.luciae都能诱导皱纹盘鲍幼苗附着。我们研究了这些硅藻适宜支持幼苗的早期生长，包括其他研究，诱导了良好的幼虫附着通常解决幼苗的高增长率和幼苗成活率（Daume等，1999）。然而在本研究中，三种硅藻的营养价值差异很大。A.luciae和N.lenzii确实营养价值高。在本研究中A.luciae是最好的单一藻类喂养，混合的二种硅藻投料是支持幼苗最好的生长跟存活。另一方面，N. laevis这个品种（Gordon，2004）是不适合做为唯一饵料提供幼苗的早期生长或

17、生存。当Takami等人（1997）喂养皱纹盘鲍幼苗时，硅藻这种结果的发现使我们想起了Cocconeis scutellum var.parva。有两种硅藻能诱导好的幼虫附着，但是对于附着后的幼虫营养有所不足。由于后来的作者观察到C. scutellum var.parva分泌稀缺的粘液和高强度的粘合剂。这些属性使得其不适合喂养幼苗，使幼苗最终饿死。与此相反，N. laevis小，硅化少和粘度低，可能更容易被食用。然而它步支持幼苗的生长，有96%的幼苗在几天后开始停止食用这种藻，最终在2个星期内死亡。这一观察表明，鲍鱼虾苗不喜欢N.laevis长时间作为唯一的食物，原因尚未确定。这可能是N.l

18、aevis分泌不利或有毒物质在喂养中逐步积累（Wen和Chen，2002）。对虾苗一个良好的增长显然是于健康的饮食有关，据显示A. luciae和 N. cf. lenzii两种最好的藻具有协同作用，在本研究中这两种藻同时当做食物，幼苗增长最快、壳长最大，同样Epifanio（1979）也建议。然而，Kawamura等。 （1998年）表明，一个良好的饮食的好处不一定是稳定、持续的，正如我们在A.luciae和N. laevis的混合显示。这种混合物的营养价值是多变的，可能反映了双重功能。其中，全蟾显然提供虾苗摄食后刺激解决的权利，而答luciae提供了更多的持续增长所需的均衡营养。喂养N.

19、laevis显示提供幼苗摄食的刺激，而A. luciae提供了幼苗持续生长所需的营养。这种混合投料因此可以支持附着后的前两周最好的增长。随后，同样的原因导致幼苗拒绝摄食单一N. laevis，喂养几天后明显开始起作用，使这种混合物不适合进一步的生长。营养发展对于幼苗年龄与似乎包括了喂养效率和消化力的提高，在幼苗附着后13-24天大多数投料都促进了幼苗生长率。这个现象已经被其他研究者指出（Martinez-Ponce和Searcy-Bernal，1998；Kawamura等，1998；Robert等，1999）。在实验的第四周中，当他们超过1毫米长时可能由于培养基内的生物密度过大，幼苗的增长率有

20、所减少（Kawamura等，1998）。4.2硅藻的营养价值这三个硅藻中的蛋白质，被认为对幼鲍是最佳的（Mai，1995b）。他们的高蛋白质品质，大概也彼此相似(Brown和Jeffrey等,1995)。由于硅藻的生长情况（营养，光照和温度）相似，并在同一生长阶段收获，我们就可以认定他们的氨基酸组成也相似(Brown和Jeffrey，1995；Brown等，1997)。反之，如Martin-Jezequel等（1988）、De Roeck-Holtzhauer等（1993）、Derrien等（1998）所说，在硅藻间游离氨基酸(FAA)的组成是有所变动的，每个硅藻都以不同的FAAs为主。在A.

21、 luciae，我们的最好单一藻种喂养，三种占主导的氨基酸是等量的。N. cf. lenzii以脯氨酸为主，支持幼苗温和而稳定的生长。脯氨酸被认为是软体动物一种必需氨（Harrison，1975)，是鲍鱼早期发育阶段组织中的FAA pool一个主要组成部分(Litaay等，2001)。不过，精氨酸，一个经常被限制的鲍鱼幼苗必需氨基酸（Mai等，1994），在in N. laevis中是最主要的氨基酸，这是另外两个物种饮食中所没有的。良好的脂质也是硅藻的主要营养价值。在三种硅藻的研究中，总脂含量值是幼鲍生长所需最大的2倍(Uki等，1986，Mai 等，1995).。在三个硅藻的多不饱和脂肪酸的

22、相对含量在比较同样大小的硅藻要高(Volkmanet等，1989；Renaud等，1999)，多不饱和脂肪酸n 3与 n 6比例也一样。这些脂肪酸组都被认为对皱纹盘鲍幼鲍生长至关重要（Uki等，1986；麦等，1996）。在这个硅藻的研究中，必需脂肪酸20:5n-3（EPA）的是n-3多不饱和脂肪酸的主要成分，其他硅藻也是(Dunstan等，1994)。据报道，这多不饱和脂肪酸，促进皱纹盘鲍幼鲍快速增长（Mai等，1995,1996;Dunstan等，1996）。事实上，我们两个'较好'硅藻N. cf. lenzii和A. luciae比N. laevis载有较大部分的n-3多不饱和脂肪酸，尤其是EPA（尽管后者仍具有较高的EPA含量高于其他物种，Renaud等人的实例报道，1999）。另一方面，在我们最糟糕的硅藻，N.laevis，多不饱和脂肪酸主要以n-6，尤其是花生四烯酸20:4n-6为主。这些多不饱和脂肪酸对鱼类幼体阶段是很重要的，但没有特别的报道对鲍