高效液相色谱法测定血浆中雷公藤甲素和雷公藤酮(精)

1、高效液相色谱法测定血浆中雷公藤甲素和雷公藤酮王朝虹 1, 张吉林 2, 何 毅 1, 侯小平 1(1. 公安部物证鉴定中心, 北京 100038; 2. 黑龙江省公安厅, 哈尔滨 150008作者简介 王朝虹 (1974- , 女 , 北京人 , 助理研究员 , 博 士 , 主要从事毒物分析工作。摘要 目的 建立高效液相色 谱法定 量检测人 血浆中 雷公藤 甲素和 雷公藤 酮的分 析方法。 方法 以 OasisHLB 固相萃取柱对样品进行提取, 应用 HPLC 色谱法二极管阵列检测器测定。 结果 该方法的回收率 高于 80%, 线 性范围在 101000ng/ml, 经该方法 测得雷公藤甲素的

2、最小 检出限为 3 0ng/ml, 雷公 藤酮的 最小检出 限为 4 5ng/ml (S/N 3 。结论 该方法快 速灵敏、准确 , 适 用于雷公藤中毒的法医学检验。 关键词 法医毒物分析 ; 雷公藤甲素 ; 雷公藤酮 ; 高效液相 ; 固相萃取文献标识码 A文章编号 1001-5728(2004 05-0268-03Determination of Triptolide and Triptonide in plasma by HPLC ( Wang Zhao hong, Zhang ji lin, He Yi, et al. /Forensic Science Institute o f P

3、ublic Security Ministry , Bei j ing 100038, ChinaAbstract Objective To establish a method for quantitative determination of triptolide and triptonide in human plasma sa mples by HPLC. Methods The samples were extracted with Oasis HLB solid phase extraction cartridge and analyzed with reserved phase

4、HPLC coupled with diode array detection. Results Recoveries rates obtained from spiked plasma for the two diterpenoid were higher than 80%.The linearity ranged from 10ng/mlto 1000ng/ml.Detection limits of the method were 3 0ng/ml for triptolide and 4 5ng/mlfortriptonide. C on clusion The method is f

5、ast and accurate, which is applicable to determination of diterpenoid in cases of suspected poisoning of Triptergium wilfordii Hook f in forensic practice.Key words Forensic toxicological analysis; Triptolide; Triptonide; HPLC; SPE 雷公藤 (Triptergium wilfordii Hook f 为卫矛科 植物雷公藤的 根。分布于长江流域以南及西南 , 主 产于长

6、江中、下游地区 1 。同属植物 尚有昆明山海 棠 (T Hypoglaucum (Levl Hukeda 、东 北 雷 公藤 (T Regelli Sprague et Takeda等 2。在传统中医中雷 公藤具有活血化瘀、清热 解毒、消肿散 结、杀虫止 血等功效。目前从雷公藤属植物中分离得 70 余种成 分 , 主要是生 物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类 及多糖。雷公藤 的主要活性成分为二萜类及生物碱 类 , 具有毒性 , 以二萜类 化合物毒性最 强 , 主要对 心、肝、胃肠道 及骨髓等 器官损伤 严重3。有资料统计雷公藤的毒副作用在 传统药物中居第三位 , 仅 次于洋金花和乌头 4, 据不

7、完全统计 , 19811997年 间发生雷公藤中毒 317 例 , 其中死亡 90 例 5 。目前 , 对于 雷公藤属植物中二萜 化合物的分析 多集中于主要有效成分雷 公藤甲素在生药、粗提物 以及各种制剂中的含量测 定 , 分析方法有薄层扫描 法 6 、气相色谱法 7、高效液相色谱法 8-10, 关于其他二萜化合物测定方法报道很少11, 12, 人体液及组织中该类二萜化 合物的测定尚未见报道。鉴 于以 上情况 , 本实验以环氧二萜类中两个主要毒性 及活 性成分 雷公 藤甲 素 (Triptolide 和雷 公 藤酮 (Trip tonide 为目标化合物 , 以人血浆为分析基质 , 应用 固相

8、萃取法提取、高效液相 -二极管阵列检测的方 法 , 建立了 快速、灵 敏、准确 的分析方 法 , 能有 效 的测定血浆中雷公藤甲素和雷公藤酮含量。1 材料与方法111仪器高效液相色谱系统 Waters 600E HPLC 色谱仪 , 配 有在线脱气机 , 717 加强型自动 进样器 , 996PDA 检 测器 , Millennium 32 色谱工作站。 1 1 2 试药雷公藤甲素及雷公藤酮 购于福建医药工业研 究 院 , 安定购于中国药品生物制品鉴定所。甲醇、乙腈、浓磷酸为色谱纯试剂 (Fisher Sci entific, Pittsburgh, PA, USA , 去离子水由蒸馏水经 M

9、illipore Simplicity 纯水系统制备。 OasisHLB 固 相萃 取柱购于 Waters 公司 (Milford, MA, USA。 1 1 3 标准溶液配制精密称取雷公藤甲素及雷公藤酮5mg 于 5ml 容量中国法医学杂志2004 年第 19 卷第 5 期瓶中 , 加少量甲 醇溶解并加甲醇稀释至刻度得浓度 为 1 0mg/ml 浓标液。精密称取安定 10mg 于 100ml 容 量瓶中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度得浓度为 0 1mg/ml 浓内标液。浓标液储存于 0 冰箱中 , 工作液在 使用前由浓标液逐级稀释制得。 1 14 仪器分析条件分析柱 :Sym metry Sh

10、ield TM RP 18 柱 4 6mm I D 250mm, 5 m, 保护柱 3 9mm I D 20mm, 5 m; 流 动相 :乙腈 水 (40 60 ; 流速 1ml/min; 柱温 40 ; 检测波长 217nm 。1 2 实验方法精密吸 取 100 l 内 标液 (1 g/ml 于 玻璃 试管中 , 40 氮气流吹干。先后于此玻璃试管中加入1ml血浆 , 20 l 浓磷酸 , 4ml 去离子水 , 涡旋混合 2min, 于 8000r/min 离心 10min, 上清液上样 Oasis HLB 固 相萃取柱 , 先后以 1ml 2%氨水 20%甲醇溶液和 1ml 2%醋酸30%

11、甲醇溶液洗去杂质 , 最后以 1ml 80%甲 醇溶液 洗脱待测样品 , 洗脱液氮气 流吹干 , 溶解 于 100 l 流动相中 , 取 20 l 进样。2 结 果空白血浆和添加雷公藤甲素和雷公藤酮血浆的 HPLC 色谱图见图 1。由图 1A和 B 比较可见此提取分离方法能有效消除血浆中内源性杂质干扰。图 1 HPLC 色谱图 A. 空白血浆 ; B. 添加 标样血浆F ig 1 HPLC Chromatograms of the sample containing triptolide and triptonide A. Blank plasma; B. spiked plasma2 1 校

12、正曲线与最小检测限于空白血浆中添加不 同浓度的标样 工作液 , 使 雷公藤甲素和雷公藤酮浓度在 101000ng/mL, 按上 述 1 2 项步骤对样品进行提取、分离 , 以测得雷公藤 甲素和雷公藤酮峰面积 /内标峰面积 (y 对添加浓度 (x 作校正曲线 , 雷公藤甲素的相关系数 r2=0 9997, 雷公藤酮的相关系数r 2=0 9991。以信噪比 3 1 计 算 , 该方法测得雷公藤甲素的最小检测限3 0ng/ml, 雷公藤酮的最小检测限4 5ng/ml 。 2 2 精密度试验日内精密度和日间精密度由 2 个添加浓度 (20,500ng/ml 评 估 , 每一浓度添加样品分别于同一日内提

13、 取 分析 5 次 和于不同两天提取分析 6 次 , 其变异系数见 表1。由表 1 可 见该方法的重现性和重 复性均较好。表 1 血浆中雷公藤甲素及雷公藤酮的精密度实验Table 1 RSD of triptolide andtriptonide in Plasm a Samples日内精密度 IntradayR SD(%日间精密度 InterdayR SD(%雷公藤甲素 4 872 3814547 24 雷公藤酮6 073 3311 007 552 3 回收率试验回收率实验选用 20, 100, 500ng/ml 血浆 3 个添 加浓度 , 每一浓度平行操作 5 次 , 回收率由添加样品 中

14、二萜化合物峰面积 /相同浓度标准品溶液中二萜化 合物峰面积求得 , 结果见表 2。表 2 血浆中雷公藤甲素及雷公藤酮的回收率 ( s Table 2 Extraction recoveries oftriptolide and triptonide in plasma samples20ng/ml100ng/ml 500ng/ml 雷公藤甲素 84 38 13 1896 32 1 9199 66 8 94雷公藤酮103 205 6492 0734387757102 4 临床应用应用该分析方法测定一 长期服用雷公藤多甙 片 治疗红斑狼疮患者 (女 , 20 岁血浆样品 , 从 该患 者血 浆 中

15、 检 出 雷 公 藤 甲 素 57 99ng/ml, 雷 公 藤 酮 10 28ng/ml 。3 讨 论本实验首先对血样中雷公藤甲素和雷公藤酮的中国法医学杂志2004 年第 19 卷第 5 期提取方法进行了考查, 经比较采用乙酸乙酯进行液-液萃取内源性杂质干扰严重 , 而由二乙烯苯和乙 烯吡咯烷酮聚合而成 Oasis HLB 固相萃取柱可在 pH1 14 范围内使用 , 因此可应用氨水溶液和醋酸溶液 除去血浆中的大部分干扰 组分 , 获得更为干净的样 品 , 且回收率也较好。因此 , 本实验选用 Oasis HLB 固相萃取柱对血浆样品进行提取。有文献报道以衍生化气相色谱 法测定雷公藤甲 素

16、7, 但雷公藤酮结构中 无活泼氢 , 无法进行衍生 化 , 因此不能用该方法同时测定这两种 化合物。本 实验试图应用 LC/MS 法同时测定雷公藤甲素和雷公 藤酮 , 但由于这两种化合物难以 电离 , LC/MS 法测 定灵敏度低于 HPLC/DAD 法 , 因此最 终选用反相高 效液相法 分析测定血浆 中雷公 藤甲素 和雷公 藤酮 , 该方法快速、灵敏、重现 性好 , 能有 效祛除复杂生 物基质中内源性杂质干扰 , 适用于雷公藤中毒的法 医毒理学检验。参考文献1 徐国钧 .生药学 M.北京 :人民卫生出版社,1994.263.2 曹敏,孙荣奇,吴达俊,等.中药雷公藤的研究进展J.中成药 ,1

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