综合实验讲义微生物胞外多糖纯化月

1、水溶性功能多糖的分离纯化一、实验原理胞外聚合物（EPS， extracellular polymeric substance），是在一定环境条件下由微生物，主要是细菌，分泌于体外的一些高分子聚合物。主要成分与微生物的胞内成分相似，是一些高分子物质，如多糖、蛋白质和核酸等聚合物。EPS普遍存在于活性污泥絮体内部及表面，具有重要的生理功能，可将环境中的营养成分富集，通过胞外酶降解成小分子后吸收到细胞内，还可以抵御杀菌剂和有毒物质对细胞的危害。EPS物质，尤其是胞外多糖物质，常被用作生物絮凝剂应用于污水处理中。而分离纯化EPS物质中的多糖组分并分析其结构，成为目前的一个研究热点。目前用来研究多糖类和

2、糖蛋白类絮凝剂组成的方法较少。由于对多糖的研究远没有像核酸及蛋白质那样成熟的方法，所以需要结合很多化学方法和仪器分析来测定糖的组成结构。测定糖的组成就要将离子交换层析、凝胶层析薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气质联用（GC-MS）等各种方法结合起来。先将多糖粗品经交换层析、凝胶层析薄层层析，然后用HPLC检测糖的纯度，再将多糖酸水解后做TLC分析就可以知道多糖中含有几种单糖组分，然后将酸解后的产物做乙酰化衍生，通过GC-MS分析就可以知道多糖由哪几种单糖残基组成及各单糖残基间的比例。有的学者还通过测定糖苷酶、蛋白酶、金属鳌合剂（如EDTA）和加热处理等对生物絮凝剂絮凝能力的破坏与

3、否，来判断絮凝剂的化学组成。Napoli报道的Rhizabium合成的絮凝剂是纤维素，絮凝能力可被纤维素酶破坏。而大多数的多糖类絮凝剂是杂多糖，Paecilomyces产生的絮凝剂是由半乳糖胺（galactosamine）组成的多糖，其中80无取代基，8的氮端被乙酰化，这种絮凝剂对热稳定，100处理也不失活。Kwon. 报道从Pesalotiopsis sp.中分离出一种絮凝剂pestan，酸水解后发现其化学组成为葡萄糖：葡萄糖胺：葡萄糖醛酸：鼠李糖=100：3.5：1.6：1.3。Nam筛选的一株Aspergillus，经分析其分泌的絮凝剂含有30%的糖醛酸，20的己糖胺和10的中性糖。目前

4、已报道的多糖类絮凝剂组分如表2所示。结构分析是了解多糖功能最基本的方法。但是多糖链的无规则性及多变化性使得多糖结构分析非常复杂。现在尚未得到多糖的单晶体，所以被广泛用来研究蛋白质的结晶学研究方法不能直接应用于多糖，只能通过对小寡糖的单晶研究及X-光衍射研究得到某些信息。另外，核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）广泛应用于多糖的结构分析及构想分析上。NMR可以提供的微观化学信息包括初级结构、立体结构及二级结构。多糖的单链构象主要由单糖残基、连接方式及侧链基团决定。糖链构象的复杂性是因为多糖链内部的相互作用非常特殊以致多糖链在溶剂中很少分散成单链的，从而造成研

5、究上的困难。多糖类絮凝剂虽然是有效的生物絮凝剂，但目前对多糖类絮凝剂的结构测定还未有成型的技术。在多糖结构测定中，多是将化学方法与仪器分析结合起来以确定其结构。目前用来测定多糖一级结构的方法有Hakamori法、改进后的Hakamori法等。Isobe采用薄层层析结合气相色谱法分析了Bacillus circulans产生的一种多糖，结构表明它是由鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖醛酸2：2：3：3组成，并用NMR分析了这四种单糖残基的连接方式。刘紫娟采用Hakamori法结合NMR分析研究了Bacillus megterium A25所产絮凝剂BP25的组成结构，表明BP25由葡萄糖：甘露糖4：

6、1组成，单糖残基间以-（1，3）及-（1，6）糖苷键连接。本实验利用离子交换层析及凝胶过滤层析分离纯化Arthrobacter.sp（节杆菌）胞外多糖样品B41，并检测其纯度。二、实验材料1主要仪器及试剂：上海沪西仪器厂层析装置（层析介质：CM Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-500）、722分光光度计、无水乙醇、PEG 20000、葡萄糖、苯酚、硫酸、蒸馏水等2实验材料Arthrobacter.sp（节杆菌）胞外多糖组分B41三、实验内容1. 苯酚-硫酸法测定总糖：葡萄糖标准曲线的制作：100g / mL葡萄糖溶液的配置，精确称取干燥的葡萄糖1 g，溶于50

7、mL蒸馏水中，溶量瓶定溶至100mL。取1mL，溶量瓶定溶至100mL。分别取该溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL(含糖1050g)置于10 mL试管中，加入50 g / L苯酚溶液0.5 mL混合后，迅速加入2.5 mL浓硫酸，混合均匀后，室温放置30 min ，在波长490 nm处测定吸光度,空白对照以蒸馏水代替糖溶液。然后以490 nm处的光吸收值为横坐标，以葡萄糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。2. ZL5-2的纯化2.1 B41的预处理：将B41溶于适量三蒸水中，装入透析袋三蒸水透析48hr，每8hr更换一次三蒸水，用硫酸苯酚法检测透析液中无单糖存在，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥得

8、B41，将B41（0.336g）溶于50mL 三蒸水中，离心，取上清备用。2.2 CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析层析柱（1×20cm），填料为CM Sepharose Fast Flow，上样量10mL，流速为0.5mL/min，2mL/管分部收集，先用蒸馏水洗涤两个住体积，再用0-1mol/L NaCl梯度洗脱两个柱体积，测定每管收集液的糖含量。收集糖含量高的活性峰组分。2.3 Sephacryl S-500凝胶过滤层析将上步收集的活性峰组分在三蒸水中透析除盐24hr，PEG 20000浓缩，层析柱（1×100cm），填料为Sephacryl S-500，上样量0.5mL，流速0.1mL/min，1mL/管分部收集，测定每管收集液的糖含量。收集洗脱液中的糖含量高的活性峰组分B41。3. B41糖组分分析取上述纯化多糖样品10mg加5mL 1mol/L硫酸2mol/L，密封试管100度水解4小时。水解后样品进行用薄层层分析，用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖等做标准样品。展层剂：正丁醇