蔬菜水果制品中亚硝酸盐与硝酸盐的HPLC法测定精

1、作者简介 吴富忠 (1964-, 男 , 副主任技师 , 主要从事卫生理 化检验工作。 化学测定方法蔬菜 、 水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的 HPLC 法测定 吴富忠 , 王恒(浙江省舟山市疾病预防控制中心 , 浙江 舟山 316021摘要 目的 :建立蔬菜、 水果及其制品中亚硝酸盐与硝 酸盐的高效 液相色谱 同时测定方 法。 方法 :样品 中亚硝酸 盐与 硝酸盐用超纯水 浸提或超声提取 , 经 活性炭 脱色 后过滤 或离 心沉淀 , 滤 液或 上清 液经 0. 45 m 水相 膜过 滤后 进样 , 在 Pheno m enex S AX 色谱柱上 , 以 0. 01mo l/L磷酸二氢钾为

2、流动相进行分 离 , 205n m 检 测 , 外 标法定 量。 结果 :该法最 低检 出量分别为亚硝 酸盐氮 0. 1mg /kg、 硝 酸盐氮 0. 07m g /kg。样品 加标回 收率 , 亚 硝酸 盐为 91. 0%101. 9%、 硝酸 盐为 94. 7%106. 0%, RSD <5%。 结论 :该方法操作较简单 , 灵敏度高 , 速度快 , 干 扰少 , 结果准 确 , 适用于 蔬菜、 水果及 其制 品中亚硝酸盐与 硝酸盐的同时测定。关键词 高效液相色谱法 ; 蔬菜 、 水果及其制品 ; 亚硝酸盐 ; 硝酸盐中图分类号 O 657. 7+2 文献标识码 A 文章编号 10

3、04-8685(2010 11-2741-03 Determ ination of nitrite and nitrate in vegetables, fruits and derived products by HPLCW U Fu -zhong , WAN G H eng(ZhoushanM un icipa l Center for D isease Contro l and P reven tion , Zhoushan 316021, Ch i naAb stract O b jective :T o deve l op a m ethod for deter m i nati o

4、n o f n itr ite and n itrate in vegetables , fru its and derived products by h i gh perfo r m ance li qui d chroma tog raphy . M ethods :T he analytes w ere ex tracted w ith u ltrapure wa ter u ltrason icall y wave , and then deco l orated w it h active carbon or cen trifug ed , filtrate o r supe rn

5、ate w as filtered by 0. 45 m filter membrane . T he sepa ration w as carr i ed out on a Phenom enex S AX co l u m n w ith 0. 01m o l/Lmonopotassi u m phospha te as m ob ile phase and detected at 205nm T he quantifica ti on w as acco m pli shed by exte rnal standard m ethod . Re s u lts :T he detecti

6、on li m its o f thism e t hod f o r n i trite -n itrogen and n itrate-n i trogen w as 0. 1m g /kgand 0. 07mg /kg,and the recover i es w ere ranged fro m 91. 2%101. 9%and 94. 7%106. 0%respecti ve l y w it h R S D s l ess than 5%.Con clusi on :T he m ethod i s si m ple , sensiti ve , rap i d , practi

7、ca, l accu ra te and w hich is su itab l e for the de ter m i na ti on o f nitrite and nitrate in vegetab l es , fru its and de ri v ed products .K ey words HPLC ; V egetab l es ; F ru its and der i ved produc ts ; N itrite ; N itra te蔬菜、 水果及其 制品 中亚硝 酸盐 和硝 酸盐 的标 准测 定方 法是 G B /T15401-1994! 水果、 蔬菜及其制品

8、亚硝酸盐和硝酸 盐含量 的 测定 和 GB /T5009. 33-2010食品 安 全国 家 标准 ! 食品中亚硝酸盐与硝酸 盐的 测定 , 两标 准均采 用盐 酸萘乙 二胺直接 显 色 法和 镉 柱 还 原 法测 定 ; 其 中 GB /T5009. 33-2010食品安全国家标准新增了离子 色谱法。在标 准检测方法 中 , 硝 酸 盐 的 测 定 , 化 学 比 色 法 需 通 过 镉 柱 还 原 为 亚 硝 酸 盐 1, 2; 离子色谱法需将样品提取液经多 种预处理 小柱处理后 才能进样且出 峰时 间较长 2, 操 作均 较繁 琐。本研 究根 据实 际 , 将样品中亚硝酸盐和硝酸盐用 去

9、离子 水浸提 , 活性 炭脱色 后过滤或离心沉 淀 , 滤液或 上清液经 0. 45 m 水相膜 过滤 , 滤 液直接进样 , 205n m 紫外检测 , 结果准确、 快 速 , 能 同时测定蔬 菜、 水果及其制品中亚硝酸盐和硝酸盐。 1 材料与方 法1. 1 仪器A g ilen t 1100液相色谱 仪 (美国 安捷 伦公 司 , 包 括 Ag ilent Che m Stati on 工作站、 四元梯度泵、 真空 脱气箱、 恒温 柱温箱、 紫 外检测器。M illipore M illi-Q 纯水 系统 (Mo lshe i m F rance; O r i on 828型 p H 计

10、(U S A ; I KA T25可调高速匀 浆机 (德国 ; SB2200超 声波清 洗器 (上 海 Branson ; 水 浴 箱 ; 离心 机 (4000r /mi n ; J Y 5002型电子天平 (精度 0. 01g, 上海精宏科器 。1. 2 试剂0. 01mo l/L磷 酸 二 氢 钾 (HPLC 级 , 10%磷 酸 调 p H 至 3. 2 ; 10%磷酸 ; 220g /L乙酸锌 ; 106g /L亚 铁氰化 钾 ; 超纯水 (电阻率为 18. 2M #c m ;标准 储 备 液 :称 取 优 级 纯 亚 硝 酸 钠 0. 2463g 、 硝 酸 钠 0. 2963g 溶

11、于水 并定容至 500m , l 浓度为 0. 1m g /ml(以氮 计 , 下同 。2741中国卫生检验杂志 2010年 11月 第 20卷 第 11期 Ch i n ese Jou r n al ofH ealth Laborat ory Tec hno l ogy , Nov 2010; Vo l20 N o 111. 3 色谱条件检测波长 :205nm ; 色 谱柱 :Phenomenex S AX 80A (250 4. 6mm 5 m ; 流 动相 :0. 01m o l/L磷 酸二 氢 钾 溶液 (p H =3. 2; 流速 1. 5m l/mi n ; 柱温 :30%; 进样

12、量 10 l 。 1. 4 实验方法1. 4. 1 试样测定 取新 鲜蔬菜中 食用部 分 , 用自来水 洗去泥 土 , 然后用去离子水漂净、 凉干、 切碎 , 水 果 (去 核 及其制品剁 碎后 , 称取 50g 左右样品 与水按 1&1比例 用高速 匀浆 机匀浆 后称取 10g , 加约 80m l 水 , 70%水浴提取 20m i n , 冷却后各加 1m l 220g /L乙 酸锌 和 106g /L亚 铁氰 化 钾 溶 液 , 水 定 容至 100m , l 加适量活性炭脱 色 , 混匀后 过滤 或离 心沉淀。 滤液或 上清液经 0. 45 m 滤 膜 过滤 至 自 动 进

13、样器 样 品 瓶 中 , 进样 10 l 测定。液体样品按固 形物含量 不等 1&11&5直 接用水 稀释 , 从冷却后按固体样品方法处理。1. 4. 2 标 准 曲 线绘 制 各 准 确 吸 取 0. 1m g /ml 标 准 溶液 10. 0m l 于 50m l 容量瓶 , 用 水稀释至刻度 , 配成 20. 0 g /ml 亚 硝 酸 盐 氮、硝 酸 盐 氮 溶 液 , 再 逐 级 稀 释 10倍 稀 释 成 2. 00 g /ml 、 0. 20 g /ml 、 0. 02 g /ml 标 准系 列溶 液 , 分 别进 样 10 l 。 以亚硝酸盐氮、 硝酸盐氮含量为

14、横坐标 , 峰面积为纵 坐标 , 绘制标准曲线。 2 结果与讨论 2. 1 实验条件选择2. 1. 1 样品预处 理 由 于蔬 菜、 水果 及其 制品 中蛋 白质、 脂 肪等大分子有机 干扰 物质含 量极 低 , 且此 类样 品中 含有 大量 的水分 , 有形成分中除纤维素外主 要是一 些水溶 性维生 素、 糖 类、 无机盐、 有机 酸等 小分 子物 质。因 此 , 样品 中目 标成 分的 提取与净化变得 非常 简单 , 只需 用去 离子 水浸 提后 用活 性炭 脱色 , 以减少叶绿素等色素对测定的 影响。试验了 70%水浴、 不同时间直接浸提与 加约 70%水后超声提取不同 时间时的提 取效

15、 果。试 验 结 果 表 明 在 70%温 度 时 , 两 种 提 取 方 法 在 15m in60m i n , 提 取 效果 相 同。标 准添 加 回收 达 到 91%106%。本法选用 70%水浴直 接浸提 20m i n 。 2. 1. 2 色谱条件选择2. 1. 2. 1 色谱柱 不同的色谱柱因性能不 同对目标成分的分 离能力差异很大。文献资料中 测定硝 酸盐与 亚硝酸盐 基本上 采用不同品牌的 C 18柱 3,4, 7或 OD S 柱 5, 6, 因被测 成分的强阴 离子特性 , 需用离子对试剂与硝酸 根、 亚硝酸 根阴离子 形成中 性缔合物才能测定。而色谱柱 对含有 离子对 试剂

16、的流 动相进 行初始平衡时 , 色谱柱吸收和释放 离子对 试剂的 过程缓 慢 , 色 谱柱平衡较慢 , 需 在确 保保留 值能 重现 后再 进行 测定 4。因 此 , 根 据 被 测 成 分 的 强 阴 离 子 特 性 , 选 用 强 阴 离 子 交 换 柱 (SAX 进行测定。2. 1. 2. 2 流动相 流动相对被测成分与干 扰成分的分离影响 主要有三个方面 :流 动相 本身 组成 ; 流 动相 浓度 与流 速 ; 流动 相的 p H 值。高效液相色 谱法中 流动 相的 选择随 色谱 柱和分 离对象的不同而不同。本 方法参 考文献 35, 7, 分别用 磷酸二 氢钾溶液、 甲醇 -磷 酸盐

17、溶 液和 乙腈 -磷 酸二 氢钾 溶液 作流 动相 , 并进行比对。试验结果表明 , 文献 4, 5, 7介绍 的流动相在 , 3分离 , ,出峰快。在其他条件相 同下 , 流 动相用 0. 02m o l/L和 0. 01mo l/L浓度的磷酸二氢钾溶液 , 目标成分 的出峰时 间 , 低浓度 时亚硝 酸根 和 硝 酸 根 出 峰 时 间 显 著 延 长。 如 在 p H 3. 2、 流 速 1. 0m l/mi n 时 , 亚硝酸根 和硝酸根出峰时间分别从约 7. 2m i n 、 9. 8m i n 延长 到 12. 5m i n 、 15. 5m i n , 且 信号值 相同。经试 验

18、 , 用 p H =3. 2的 0. 01m ol/L磷 酸 二 氢 钾 溶 液 , 流 速 为 1. 5m l/mi n 时目标组分间和 目标 组分与 干扰 成分间 分离 效果 达到最佳 , 且目标成分出 峰时间 较流 速为 1. 0m l/mi n 提 前到 流速为 1. 0m l/mi n 流 动相 浓度 0. 02m o l/L磷 酸二 氢钾 时相 同。流动相 p H 影 响 :由于色谱柱性能关系 , 流动相的 p H 对目 标组分分离度有很大影响。流速为 1m l/mi n , 0. 02m o l/L磷酸 二氢钾溶液 p H 3. 7时 , 目标成分 间分离不 完全 , p H 3

19、. 9两 峰重叠 ; 而用稀 磷酸调 流动相 p H (3. 6时 , 两峰分 离完全 , 且 亚硝酸根的出峰时间随流动相 p H 的降低明显 提前 , 硝 酸根的 出峰时间延后 , 两目标组分的分离度增大 , 分离更加良好 。 2. 1. 2. 3 柱温 由于色谱柱 为强极 性阴离 子交换 柱 , 在固定 其他条件下经试验 , 20%、 30%、 40%柱温时对目标成分分离与 出峰时间基本不产生影响 , 本法采用 30%。2. 1. 2. 4 波长 参考文献 , 对亚 硝酸盐 和硝酸 盐进行 紫外吸 收波长扫描 , 亚硝酸盐最大吸收波长为 202n m 210n m, 硝酸 盐最大吸收波长为

20、 201nm 206n m, 在 200n m 210nm 波长 范围 , 最大吸光度相对平坦 , 大 于 210n m 吸 光度下 降明显 , 本 法选用 205n m 。根据以上 试验 结 果 , 选 择优 化 色 谱分 离 条件 :流 动相 为 0. 01m o l/LKH 2PO 4-H 3PO 4缓 冲 液 (p H =3. 2 , 流 速 1. 5m l/mi n , 检测波长 205n m, 柱温 30%。标准色谱图见图 1。图 1 亚硝酸盐与硝酸盐标准色谱图 (1:NO -2; 2:NO -32. 1. 3 干 扰 试 验 常 见 的 无 机 阴 离 子 C l -、 SO 2

21、-4、 SO 2-3、 PO 3-4、 CO 2-3、 F -等及山梨 酸、 苯甲 酸、 甜蜜 素、 糖 精钠、 安 赛蜜 等常用的食品添加剂 , 对硝酸盐和亚硝酸盐测定不产生干扰。 2. 2 线性范围与最低检出限2. 2. 1 线性范围 在本实 验条件 下 , 亚 硝酸盐 氮与硝 酸盐氮 含量在 0. 02 g /ml 20. 0 g /ml 范围 , 标准含量 C 与峰面积 A 有良好的线性关系 , 标准系列回归方程分别为 A =160. 842C +0. 4487, A =340. 098C+0. 3612其相关系数均大于 0. 9995。 2. 2. 2 最低检 出限 取浓度 为 0.

22、 020 g /ml 标准 溶液 进样 10 l 分 析 , 按 3倍 声 噪 比 (S /N 计 , 本 法 最 低 检 出 限 为 0. 005 g /ml 、 0. 0035 g /ml 。 若取 5. 0g 原 样 品提 取 定容 至 100m l 测 定 , 对 应 的 最 低 定 量 检 出 量 为 0. 1m g /kg、 m 2742中国卫生检验杂志 2010年 11月 第 20卷 第 11期 Ch i nes e J ournal ofH ealt h Lab oratory T echnol ogy , N ov 2010; Vol 20 No 112. 3 方法加标回收率

23、试验取 10g 左右 1&1打成 匀浆软 包装 蔬菜制 品和 腐菜 样品 , 分 别加入 20 g /ml 的标准液 1. 00m l 、 5. 00m l 、 50. 0m , l 按 1. 4实验方法提取后测定 , 结果见表 1。表 1 加标回收试验结果样品 编号 NO -2-N 本底值 ( g /m l 加标量( g /ml 加标测定 值 ( g /ml 回收率 (% NO -3-N 本底值 ( g /ml 加标量 ( g /m l 加标测定 值 ( g /m l 回收率(% 1ND 0. 200. 18291. 03. 206/2ND 1. 000. 99299. 23. 20

24、61. 004. 246104. 03ND 10. 0010. 08100. 83. 20610. 0013. 43102. 240. 1510. 200. 34195. 00. 6130. 200. 825106. 050. 1511. 001. 170101. 90. 6131. 001. 59798. 460. 15110. 0010. 1199. 60. 61310. 0010. 0894. 7注 :ND: 未检出2. 4 方法精密度试验在 新 鲜 蔬 菜、 软 包 装 蔬 菜 制 品 和 果 汁 样 品 , 分 别 加 入 100 g 标准液 , 各测定 6次 , RSD 值 NO

25、-2在 1. 59%4. 37%、 NO -3在 2. 07%4. 68%之间。 2. 5 方法比较用本法和 GB 5009. 33-2010食品中亚 硝酸盐与硝酸盐测 定不同样品进行方法 比对 , 结果见下表 2。将数据各自进行配对 t 检验 , 计算得 t 亚硝酸 盐 =1. 272, t 硝酸盐 =1. 228, 查 t 值表 , 均小 于 t 0. 2, 4=1. 533, 故 P >0. 2, 2组结 果均 无显 著性 差异。 因此 两种检测方法 的测定 结果 无显著 性差 异。 (亚 硝酸 盐测 定配 对 t 检验时 , 统计量指标中 ND 取 1/2值 。表 2 国标法与本法对不同样品测定结果检测项目 样品名称 亚硝酸盐 (mg /kg本法 国标法 硝酸盐 (mg /kg本法 国标法 新鲜蔬菜 苹果 软包装榨菜 瓶装果汁 腐菜ND ND ND ND 3. 00ND ND ND ND 2. 942. 734. 7864. 34. 6412. 32. 685. 0866. 24. 5112. 5注 :ND :表示小于方法检出限 (本法 ND<0. 1m g/kg, 国标法 ND<0. 2m g/kg3 小结试验 采用 25c m Phenom enex S