(完整word版)柱离心法纯化质粒DNA

1、柱离心法纯化质粒DNA一、实验目的·学习柱离心法纯化质粒DNA二、实验原理·离心柱结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA ，而 RNA 与蛋白质穿过。在正常情况下， 核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。 高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。 在此环境中， 核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。·碱变性抽提的原理是在 pH 高于 12.6 的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，破坏了碱基配对，导致双螺旋结构解开而变性，但闭环的质粒DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

2、当 pH 调至中性时，质粒DNA 链迅速恢复到原来构型，仍保存于溶液中。而变性的染色体 DNA 不能再复性，通过离心，随不稳定的大分子RNA 、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。三、实验器材与试剂·试剂盒自带溶液、·漂洗液、结合缓冲液、洗脱缓冲液、TE buffer·器材：吸附柱、取液枪、离心机 、低压 电泳仪 、水平电泳槽、紫外透射仪四、实验步骤1.培养细菌： 将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml 含有相应 抗生素 的液体培养基，37培养 1216 小时 ;2.取液体培养液 3ml （ 1.5mlX2) 于 Eppendorf 加入 1

3、00ml 溶液 I ，充分混匀 ;置冰上 ;管中， 10000r/min离心1min ，去掉上清液，3.加入 150ml溶液 II，加盖颠倒6-7 次使之混匀，冰上放置1 2min;4.加入 150 m l 溶液 III，加盖后颠倒6-7 次混匀，冰上放置5min;5.用台式高速 离心机 ， 12000r/min离心 10min;6.吸附柱中加入420ul结合缓冲液，将步骤5 中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀，12000r/min离心 1min7.取下吸附柱， 倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul漂洗液 , 静置 1 min ， 12000r/min

4、 离心 30 s；8.重复步骤7 一次9.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，12000r/min离心 2min10. 吸附柱放入一个新的 1.5ML 室温放置 3 5 分钟。盖好盖子离心管 ，在吸附柱的中央加40ul12000rpm离心 1 分钟，收集质粒洗脱缓冲液或DNA 溶液。TE buffer,11. 取 5ul 电泳检查， (100ml 凝胶加入5ul 染料 )注：加样时要排出枪头中的空气，以免搅动液面12. 电泳结束后（溴酚蓝走到胶的正中位置附近），将凝胶拿到成像系统中拍照。五、实验结果·由近到远各条带分别显示：环状DNA 、线性 DNA 、超螺旋 DN

5、A 、 RNA但是 DNA 各条带显示并不十分清晰，也不是全部都可以看到，这可能与加样时的操作未能使得所有样都进入沟槽中有关。注：用柱离心法纯化的质粒DNA 没有 RNA 的显示·原因分析：特殊硅基质吸附材料可以特异地吸附DNA ， RNA 则会穿过，被基本去除，而实验一的离心法在吸取水层时或多或少会吸取到下面的有机层，使得最后得到的物质中有RNA 的存在。六、实验讨论·分离纯化质粒DNA 的方法很多，通常是利用它与细菌染色体DNA 在特性和构型上的不同而进行的。目前常用的有碱变性法、煮沸裂解法、羟基磷灰石柱层析法、酸酚法、两相法以及氯化艳 -溴化乙锭密度梯度离心法。这些方

6、法各有特点， 但它们都含有以下三个基本步骤，即：培养菌体和扩增质粒；收获和裂解菌体；纯化质粒DNA 。·在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在.在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外 ,还会产生其它形式的质粒DNA.如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA, 简称ocDNA); 如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA).当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。·该方法抽提质粒主要的试

7、剂为溶液I,II 和 III, 其在抽提质粒DNA 中的作用如下 :溶液 I: 由葡萄糖 ,EDTA ,Tris Cl 组成 .葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用 ,防止破坏质粒DNA; EDTA 的作用是络和掉Mg 2+等二价金属离子, 防止 DNA 酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适pH 范围。溶液 II:由 SDS 与 NaOH 组成。 SDS 的作用是解聚 核蛋白 并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH>12) 的作用是破坏氢键,使 DNA 分子变性。溶液 III:由 KAc 与 HAc 组成 ,是 pH 值为 5.5 的高 盐溶液 .能中和溶液II 的碱性 ,使染色体DNA 复性而发生缠绕并使质粒DN