多肽类药物制剂研究现状 - 方宏清-

1、多肽类药物制剂研究现状方宏清(军事医学科学院生物工程研究所北京100071摘要多肽类药物制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好、体内半衰期短和生物膜透过性差。本文综述了多肽类药物不稳定的原因;提高多肽稳定性的方法;多肽类药物制剂货架时间的确定;多肽类药物的分析手段;多肽类药物的控释研究;多肽的非注射途径给药研究。最后还提出了多肽类药物制剂研究的展望。关键词多肽药物制剂稳定性控制释放非注射途径给药随着生物技术的发展,多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛,相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统的小分子有机药物相比,多肽具有稳定性差,体内半衰期短和不易通过生物膜等特点。本文从稳定性、缓释系统、非注

2、射途径给药三方面对多肽类药物制剂的研究概况进行介绍。1多肽的稳定性研究1.1引起多肽不稳定的原因13(1脱酰胺反应在脱酰胺反应中, Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关。提高pH值、升高温度都将有利于脱酰胺反应的进行。在-Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。(2氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中, Met、Cys和H is、Trp、Ty r等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。(3水解多肽中的肽键易水解

3、断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。(4形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。(5消旋除Gly外,所有氨基酸残基的碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。(6-消除-消除是指氨基酸残基中碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Th r、Phe、Ty r等残基都可通过-消除降解。在碱性p H 下易发生-消除,温度和金属离子对其也有影响。(7变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以

4、恢复。在多肽变性过程中,首先形成中间体。通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题,如r IL-2在进行灌注时会吸附在管道表面,造成活性损失4。1.2提高多肽稳定性的途径1,3(1定点突变通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳军事医学科学院青年科研基金资助项目定性的残基,可提高多肽的稳定性。(2化学修饰多肽的化学修饰方法很多,研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物,在体内可降解,无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延长体内半衰期5。选择合

5、适的修饰方法和控制修饰程度可保持或提高原生物活性。(3添加剂通过加入添加剂,如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类,可以提高多肽的稳定性6。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围,因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中,上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象,而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tw een、Pluro-nic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。(4冻干多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、-消除、水解等都需要水参与,水还可以作为其它反应剂的流动相。另外,水含量降低可使多肽的变性温度升高7。因此,冻干可提高多肽的稳定性。1.3多肽

6、类药物制剂的存放时间测定对动力学行为符合Arrhenius公式的药剂,可利用加速实验确定存放时间,但要求反应活化能是独立于温度的常数。通常认为基于Arrhenius公式的稳定性预测不适于多肽制剂,这是因为在进行蛋白质药物加速实验时有三个问题难以解决:(1多肽的降解途径较多,各途径活化能不同,升高温度会改变多肽降解的主要方式;(2温度会改变多肽的构象,从而改变降解反应的活化能;(3对冻干制品,若实验温度高于玻璃化温度(Tg,固体制剂将由玻璃态变为粘塑性状态,化学反应速率将急剧增加,从高于Tg获得的数据就不能外推到低于Tg时的情况。但是,如果能解决上述问题,利用加速实验进行稳定性预测就可以成为评价

7、多肽药物制剂的有效工具。Yo shio ka等人8通过加速实验确定了六种多肽制剂在25存放的有效时间,结果表明与实测结果基本接近。这说明在一定条件下可用加速实验估算多肽制剂的货架时间,特别是在研究初期,用加速实验可节省大量时间和物力。但是,最终货架时间的确定还是需要采用留样观察法。1.4多肽类药物制剂的分析手段多肽类药物制剂研究常用的分析手段有:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、凝胶过滤层析法、反相液相层析法、紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、圆二色性光谱法、量热法以及生物活性测定法9。这里仅介绍药物制剂研究中常用的一种方法量热法(Calorimetry。量热法是通过测定样品在受

8、热过程中的放热和吸热行为来研究样品中各组份的相互作用及状态变化的一种方法,常用的是差示扫描量热法(Differentiat Sca nning Calo rim etry。该方法广泛用于多肽的热稳定性分析、各种添加剂对多肽结构的影响、多肽与配基之间的相互作用等研究,还用于测定冻干物品的玻璃化温度和共熔点。例如, Chan等10用DSC研究了添加剂对rh DNase 溶液热变性的影响。蛋白质浓度为10mg/ ml,扫描速率为1.2/min。测得rh DNase 在纯水中的Tm=67.4,Hm=18.0J/g。加入Ca2+有利于rh DNa se的热稳定,加入Mg2+、M n2+则不利于rhDNa

9、se的稳定。当Ca Cl2浓度为20100mmol/L时,Tm=76. 4,Hm=2022J/g。Ca Cl2和乳糖对rh D-Nase的稳定有复合作用。同时加50mmol/L Ca Cl2和100mg/ml乳糖,可使rh DNase的Tm值提高到76.4,Hm值到21.9J/g。Chang等11用DSC测定了rh IL-lra制剂的玻璃化温度、反玻璃化温度和共熔点。冷冻蛋白制剂的各种物理变化,如玻璃化、反玻璃化和共熔都会影响冻干过程。根据测定结果,作者确定了冻干温度和升温速度,仅用6个小时就完成冻干过程。2多肽类药物的缓释制剂研究多肽类药物在血液中的半衰期一般很短,静脉注射后很快就被清除或降

10、解,因此需要经常给药,给病人带来较多不便。为了减少给药次数可采用缓释或控释技术:(1在注射液中加入高分子聚合物(如透明质酸,提高粘度、延缓药物扩散速度;(2将多肽包裹在脂质体中,使多肽从脂质体中缓慢释放出来;(3将多肽包裹在固体微粒中,使多肽从微粒中缓慢释放出来。在上述方法中研究最多的是微粒递释系统。适于制备微粒的生物可降解材料有:聚乳酸、丙交酯和乙交酯共聚物(PLC A、聚己内酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚腈基丙烯酸烷基酯12。多肽的微囊大多采用聚酯材料,特别是用PLGA。PLGA微粒释放蛋白质的典型曲线分三相:起始爆释相、扩散控释相和分解控释相。起始爆释是指位于微粒表面或近表面的蛋白质在

11、几小时内的快速释放。扩散控释是蛋白质通过微粒中孔道扩散释放。为了获得连续释放,扩散控释相必须与分解控释相重叠,聚合物分解形成的孔隙使包裹的蛋白质连续释放。而主要的困难是降低起始爆释,增加药物载量。已用该法制备了许多肽和多肽的微粒剂型,如LHRH、T RH、Insulin、GH、SOD、TN F、IFN、IL-2、EPO等。其中LHRH类似物leuprolide的微粒制剂可控制释放药物长达一个月,并于1988年首先在法国上市,随后又在欧美40个国家上市,1993年起在我国销售。美国Genetech公司的研究人员也成功地制备了连续释放一个月的rh GH和IFN-微囊制剂13,14。3非注射给药途径

12、研究多肽类药物分子量大,脂溶性差,难以透过生物膜,一般只能注射给药。但注射给药、尤其是那些需要频繁给药的药物,对病人来说是极其不便的。因此有必要进行多肽的非注射给药途径研究。文献报道的多肽非注射给药研究途径有:鼻腔、肺部、眼、舌下、口服、直肠、阴道、皮肤等,其中研究最多的是鼻腔给药、肺部给药和口服给药。3.1鼻腔给药鼻腔部位存在丰富的毛细血管和淋巴管,鼻腔上皮与血管壁紧密相连,上皮细胞间间隙较大,具有较高的渗透性,能避免肝脏的首过效应,鼻腔部位蛋白酶含量也比胃肠中少。低分子量的药物极易被吸收进入血液循环。对分子量较大的多肽,如降钙素、胰岛素、G-CSF、EPO等,在合适的吸收促进剂帮助下,也可

13、被吸收,但生物利用度较低15。鼻腔给药的方式有滴鼻给药法和喷雾给药法,采用后一方法可获得相对较高的生物利用度。目前降钙素(32肽已有鼻腔递释制剂在欧洲、日本及美国上市,尽管其绝对生物利用度不足1%。1990年在美国上市的Nafa relin (十肽鼻腔喷雾剂,其生物利用度也仅2. 8%。3.2肺部给药人肺的吸附表面积有140m2,血流量达5000m l/min,蛋白酶活性相对于胃肠道较低,不存在肝脏首过效应。肺泡壁比毛细血管壁还要簿,通透性好。动物实验表明一些多肽药物经肺给药后生物利用度相当高,可达20%50%。但某些多肽易被肺中蛋白酶降解,还有一些多肽在形成气溶胶微粒时会变性。哪一种多肽适合

14、于经肺给药需逐例分析研究。选用合适的给药装置将药物输送至肺泡组织是肺部释药的关键。粉雾剂将是肺部递释的主要剂型16。理想的粉雾剂应是:粉末处方组分在低流速和低压力差时,大部分药物粒子能够解聚,进入粉雾气流中;吸入装置则易产生流速较高的湍流。目前多肽的肺部给药还处在研究阶段,除Pulm ozy me(作用于肺部外17,还没有一种多肽药物的肺部递释制剂上市。3.3口服给药口服给药是最受人们欢迎的给药途径,多肽类药物也不例外。但是正常情况下,大多数肽类药物很少或不能经胃肠道吸收。其原因主要有:(1多肽分子量大,脂溶性差,难以通过生物膜屏障;(2胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽;(3吸

15、收后易被肝脏消除(首过效应;(4存在化学和构象不稳定问题。目前人们研究的重点放在克服前两个障碍上,即如何提高多肽的生物膜透过性和抵抗蛋白酶降解这两个方面18。使用吸收促进剂来提高生物膜通透性是目前研究中采用的主要方法。文献报道的促进剂包括水杨酸、胆酸盐、脂肪酸、螯合剂、酰基肉碱等。而Emisphere公司的研究人员在研究中发现某些氨基酸衍生物能够促进降钙素、干扰素和生长激素的口服吸收。大量研究还表明吸收促进剂具有多肽特异性。提高生物膜通透性的其它方法还有:(1将多肽与V B12连接,通过受体介导吸收;(2用脂肪酸修饰多肽,提高脂溶性。文献报道的克服多肽口服吸收酶障的途径有:(1用PEG修饰多肽

16、,抵抗酶解;(2使用酶抑制剂;(3应用微乳制剂;(4应用纳粒(na no particle.制剂;(5应用生物粘附性颗粒。直径为100nm的PLG纳粒在肠道中能大部分被吸收19,突破酶障和膜障。美国药物开发公司应用Technosphere技术制备降钙素的口服制剂,在狗体内的绝对生物利用度达26%。除环孢菌(环肽外,至今还未见多肽口服制剂的临床应用报道。据称Cortecs公司的降钙素口服制剂已进入期临床研究,有望成为第一个真正的多肽口服制剂。此外,在多肽透皮给药方面也有新进展。利用超声技术可使皮肤上形成小孔,促进多肽透皮吸收20。结语多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一,其原因较多。但

17、对某一个多肽药物来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件(如pH、温度、光照、氧浓度等对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚,使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选到合适的添加剂。应用微粒系统控制释放多肽药物是目前多肽缓释研究中的方向之一。这方面研究的主要难点有:(1改善微粒制备方法,提高收率;(2解决微粒制备过程中多肽的稳定性;(3提高药物载量;(4降低起始爆释率,获得药物连续释放。目前国外一些生物技术制药公司与药物控释研究公司利用各自的优势进行合作,研究开发进展较快。国内这方面研究也已开

18、始。近年来对多肽的非注射途径给药研究虽取得一些进展,但面临的困难仍然很多。几乎所有多肽药物的粘膜传递都需要渗透促进剂,而其种类繁杂,存在的问题是如何降低其刺激作用以及长期使用是否影响上皮完整性。用微粒代替渗透促进剂也许是很有前景的口服给药方法。目前,在克服渗透障和酶障方面虽取得了一些成绩,但尚无突破性进展。另外,多肽的肝清除问题应该受到重视,弄清肝清除机制、结构与清除之间的关系将有助于实现多肽口服给药的梦想。本文承蒙黄培堂研究员、于公义研究员和朱厚础研究员审阅,谨此致谢。参考文献1M a nning M C,Pa tel K,Bo rchardt RT.Sta bility o f pro t

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28、ary Medical Sciences,Beijing100071AbstractPoly peptide drug s a re g enerally characterized by the chemical and phy sical in-stability,sho rt biological half-life,a nd poo r permea bility acro ss biological membrane,w hich a re the main problems facing to the pharmaceutical study.This paper review e

29、d the causes of the instability,the metho ds fo r increasing the stability,the determination o f the shelf-life,非肽类纤维蛋白原受体拮抗 剂的研究进展 21 the methods of analy sis o f poly pepti de pharmaceuti cals, and the st udy o n cont ro lled release and non -parenteral admi ni strati on o f polypepti de drugs. Th

30、e prospects of resea rch on the preparati ons of po lypeptide drug w ere present ed. Key Words Poly pepti eds Prepa ra tions of Drug St abilit y Co ntro lled release No npa -renteral admi nist ra tio n ( 收稿 : 1997-07-08 非肽类纤维蛋白原受体拮抗剂的研究进展 许天林华维一倪沛洲 (中国药科大学新药研究中心 南京 210009 摘 要 纤维蛋白原受体 拮抗剂能阻止通过 各种途径激活的血 小板聚集 ,因 而可以有效地抑 制血栓的形成 。 本文综述非肽类纤维