翻译-Gradient_overview_with_notes

1、LC故障排除系列终版梯度洗脱分析概述9/21/2010 剧本文稿边栏附注前言Michael Woodman：嗨，大家好！我是 Mike Woodman，是安捷伦公司的一名应用专家。今天和我在一起的是安捷伦在线技术支持团队部的Rita Steed，你们中的一些人可能在过去曾经和他通过电话。Rita：嗨，大家好！这真是可能的! 我们接到过来自不同地区的许多求助电话。Michael：在本次讨论中，我们将关注梯度洗脱以及如何建立梯度分析方法如何建立的问题，并且讨论梯度分析中易犯的常见错误以及如何处理它们。首先，我们来重温一下梯度方程，这样就能理解当进行梯度分析时，我们如何去调整方法的变量。然后，我们来

2、讨论流动相改性剂，以及它们是如何引起基线问题的。最后， 我们将讨论延迟体积的重要性，以及如何解决它们，以避免梯度分析方法在不同系统之间转移应用时组分的保留时间发生变化。Mike Woodman 是一名应用化学家，致力于安捷伦仪器应用的研究。Rita Steed就职于安捷伦HPLC色谱柱技术支持部。 为什么使用梯度洗脱？Rita： 那么人们为什么使用梯度洗脱呢？这是由于当前随着色谱分析变得愈加复杂，因此人们越来越多地使用梯度洗脱。 当在组合化学或杂质分析中需要分离一些未知化合物如组合化学产物或产品杂质需要分离时，梯度洗脱就非常有用。梯度洗脱也有助于分离极性差异大的化合物，或者高分子量化合物，如肽

3、类和蛋白质类。在梯度洗脱中，流出各峰的宽度基本上是相同的，不像等度洗脱时，某组分在色谱柱中停留的时间越长，色谱峰就越宽。梯度洗脱还有其它的优点，包括由于梯度压缩效应使峰形更尖锐，并且由于梯度洗脱中色谱柱不断被逐渐提高强度的溶剂冲洗，从而最大程度地减少了污染积聚。梯度洗脱分析可用于： · 分离一些未知化合物· 组合化学研究· 杂质分析· 分离极性差异大的化合物，或者高分子量化合物，如肽类和蛋白质类。梯度方程Rita：我们一起来看一下梯度方程，并去理解梯度方程是如何使用的。show gradient_equation.gif这个梯度方程乍看起来有些令人生畏，

4、但如果您进一步再对它稍作了解，您就会看到事情并非想象的那样。它涉及了影响您分析的关键变量，如果您不理解这些变量，也许会给您的色谱分析带来问题。请看这是point as discussed流速、梯度程序时间、梯度范围和柱体积。谨记分母如果发生变化，分子就一定要做出相应改变来补偿，反之亦然，这一点非常重要。增大保留因子k（或k*，梯度洗脱中）是一个简单的提高分离度的方法。当然不过，这会以更长的运行时间为代价。此外，还会导致峰宽增加，峰高降低，这可能会从而使使定量分析变得更加困难。Mike：目前，改变色谱柱的尺寸非常普遍，更短或者内径更窄。因此，柱体积的任何减小，都需要通过成比例减小梯度程序时间或增

5、大流速来补偿。Rita：当我们转换应用方法到不同尺寸的色谱柱上时，一个可以帮助我们的极好途径就是使用安捷伦方法转换器软件。 它能帮您确定您是否已经调整好了所有相关的方法参数。您可以登陆，通过搜索找到方法转换器。它有几个版本， 包括在Agilent 1290 Infinity LC上适用的一款。 show search and bring up Method Translator on screenDemonstrate on screen比方说，您正在使用经典的4.6 x 250 mm，5 µm色谱柱。 您可以看到您在转换器中有两种选择：基本模式和高级模式。在本例中我们选择基本模式。

6、基本模式假定设定为您正在使用的是一台常规HPLC仪。在色谱柱部分，我们输入色谱柱的规格为内径4.6 mm、长度250 mm、粒径5 µm。在方法部分，我们需要输入温度信息，可这里设为30 ，流动相设为水/甲醇。注意当我们如上操作时，最大黏度值发生了变化。为了了解那个数值是从哪里来的，让我们去看一下黏度表。您可以看到我们有一张关于水/乙腈和水/甲醇的表，以及一张其它相关HPLC溶剂黏度的信息表。由于我们的梯度分析系在30 时使用甲醇/水作流动相，因此我们需要查看30时流动相的黏度。我们看到这个条件下该流动相的 最大黏度是1.47，这也是我们使用的转换器的默认值。接下来我们输入流速、进样

7、体积及梯度程序条件。为简单起见，我们将保持所有我们看到这里默认的条件不变。现在让我们转移到设定一个新的方法上。在基本模式下，默认的仪器是1200 RRLC系统。如果您使用的是高级模式，您可以设定系统信息以适应您使用的仪器。输入我们使用的新色谱柱的规格2.1 x 50 mm，1.8 µm。由于改变了色谱柱内径，我们可以看到转换器已经成比例地调整了流速。虽然进样体积不是梯度方程中的变量，但考虑到原色谱柱与新色谱柱柱体积的差异，软件也会成比例调整进样体积。注意由于我们改变了柱长，因此也要注意梯度程序时间的也发生了变化。在本例中，我们做了简单的转换，但是同样方法您同时还可以优化出峰速度或分离

8、度。高级模式中的其它功能还有待您去探索。Mike：使用同一根色谱柱时，如果梯度程序组成流动相配比范围中有任何变化，若要保持相同的梯度陡度斜率和k*值，就需要相应调整梯度时间或流速。对于梯度洗脱分析，影响方法耐用性的两个重要变量是延迟体积和梯度陡度。我们将首先讨论梯度陡度。show gradient_steepness.gif理解梯度方程是非常重要的。分母要相应改变（梯度范围、柱体积等）去抵消分子的变化（梯度时间、流速），反之亦然。请登陆A搜索LC方法转换器。它是一个很好的帮助您妥善进行方法调整的工具。梯度陡度Rita：我们再看一下梯度方程洗脱的保留因素值方程，以及它与梯度陡度的关系。您可以认为

9、梯度陡度b就是等度分离中有机溶剂的百分含量。当梯度陡度减小时，保留时间增大；当梯度陡度增大时，保留时间减小。并且梯度陡度减小时，峰宽增加，峰高降低。关于梯度陡度请谨记以下事项：· 只要b保持不变，您就可以看到色谱峰会以相同的相关模式相对格局被洗脱出来。· 减小梯度陡度，并不意味着一定会得到更理想的保留时间和分离度。换句话说，对于不同的分析物而言，改变有机溶剂一定的百分比，所有分析物的保留时间可能并不会均产生相同比例的保留时间变化。不同的分析物有特定的S值，该值反映了某该分子对流动相中有机溶剂百分含量的敏感度。insert molecular_vs.jpg· 对于大

10、多数小分子（<几百Da），S值约为4-5，这对它们的敏感度不会有什么太大影响。但肽类和蛋白质类的S值相对大的多，且彼此之间的差异可能会超过2-3个数量级。· 这就是为什么分离肽类和蛋白质类时必须选用梯度分离，并且较小的梯度陡度变化就会引起其保留时间较大变化的原因。为了说明方程中的这些观念概念是如何在您的色谱分析中得以体现的，让我们一起来看几个例子。insert gradient_time_example.gif这里，我们将梯度程序时间从10 分钟增加到60 分钟，但保持其它梯度参数不变。如从方程上看得到的一样，我们希望获得到了增大的梯度保留时间，并会且显著地全面改善了梯度分辨率

11、。较长的梯度程序时间会导致较缓的梯度陡度，并且通过减小梯度陡度，我们可将色谱峰1和2、6和7分开indicate。 在下一个实例中，让我们一起来看一下梯度陡度与柱长的关系。insert gradient _steepness _example.gif每张色谱图的梯度陡度是相同的，即组分均保持了相同的洗脱模式，然而分析时间却从24 分钟减少到12 分钟。在左边的色谱图中，在梯度程序时间30 min、流速1.0 mL/min的条件下，我们的样品在4.6 x 150 mm，5 µm色谱柱上得到了良好的分离。当我们将柱长减小到75 mm时， 分析时间会显著缩短，此时柱体积减小了一半，分析时间

12、也相应缩短了一半。梯度陡度没有改变，但分析时间却缩短了50%。同时减少了溶剂消耗，同时也获得了较短的色谱柱再平衡时间（译者注：此部分内容是否应该补充柱长改变后其它参数的相应调整，使该结论与其它视频相关内容的说明一致。请核对。）。 Mike： 好！我想我们对如何在实际分析中应用梯度方程已有了一个很好的感觉理解。你还听说过什么其它的常见问题吗？梯度陡度类似于等度分离中有机溶剂的百分比。当梯度陡度减小时，保留时间增大；当梯度陡度增大时，保留时间减小。请谨记以下要点：- 只要b保持不变，色谱峰就会以相同的相对格局相关模式被洗脱出来。- 减小梯度陡度，并不意味着就一定会得到更理想的保留时间和分离度。分析

13、结果是否满意取决于您的分析物。流动相改性剂与基线漂移Rita：我们经常会接到正在一些运行梯度分析的分析员打来的有关基线漂移问题的求助电话。 运行梯度程序时，基线漂移是很常见的现象。这是由于在梯度条件下，开始和结束时的梯度条件下流动相的紫外吸收不一致造成的。我们可能第一个要问求助者的问题是所用流动相里含有什么？Mike：这个表格中展示了许多常见流动相成分的紫外吸收截止波长。我们相关的视频记录中有这张表，您登陆安捷伦的官方网页 搜索“Gradient Video Notes（梯度洗脱视频记录）”即可查到。 insert table.jpg人们之所以喜欢选择使用乙腈的原因之一是乙腈的紫外吸收截止波长

14、低（190 nm），而甲醇的为205 nm，THF的为212 nm。THF在215 nm处有那么高的紫外吸收，因此它很难用于梯度分析。并且依据您的梯度范围，THF的吸收度可能会高达2 Aus。而在较长的吸收波长如254 nm处，您将可能就不会遇到存在同样这样的问题。因此在梯度洗脱分析中我们不但首先要考虑溶剂选择，接着还要进一步考虑所将使用的改性剂。1% 醋酸溶液的紫外吸收截止波长为230 nm，0.1%TFA溶液的紫外吸收截止波长为205 nm。回顾过去曾经，我个人喜欢使用磷酸盐缓冲液和稀磷酸。无论酸性还是中性pH值下，它们都具有绝对完美的紫外透光度。Rita：但是Mike，你不能每次都享受享

15、用到磷酸盐的好处，有时也会遇到它不利的一面。磷酸盐存在溶解度问题且不易挥发，在进行质谱分析时，磷酸盐会失宠于许多人就不再选用磷酸盐。Mike：是的，因此如果您使用有机溶剂的浓度大于80%，应避免使用浓度大于10 mM的磷酸盐缓冲液。并且就对于会导致磷酸盐沉淀来说，乙腈比甲醇更严重。Rita：还有当你试图简化操作而仅在流动相的水溶液部分加入改性剂时，你常会看到基线漂移。在醋酸铵和甲醇作流动相的情况下，在215 nm波长处，醋酸铵的背景吸收远大于甲醇，在梯度分析运行中这将会引起基线显著的负漂移。负漂移对于大多数数据处理系统而言尤其是一个严重的问题。为了抵消这种负漂移，您可以在流动相B中加入适量有紫

16、外吸收的化合物。理想情况下，流动相A和流动相B中的缓冲盐或改性剂的浓度应该相同。换句话说，在梯度洗脱中，当仅有有机溶剂浓度改变时即可才能获得最理想的色谱分析结果。当然也会有例外。对于一些流动相改性剂，它们在水中和乙腈中的吸收度不同，这可能会在梯度形成后导致基线漂移。TFA就是这样那样一个例子，我们导致一些常见到的问题的例子。当我们使用TFA时，尝试使它在溶剂A中的浓度使用为0.1%时 ，在溶剂B中即的浓度约为0.09% 。 现在我们一起来看一张色谱图，说明一下这个问题。insert effect _of_ tfa.gif在这个梯度洗脱分析中，流动相A和B中含TFA均为0.1% ，在215 nm

17、波长下检测时，基线向上发生漂移。如果我们将流动相B中TFA的浓度调整为0.09%这一较低的值时，就可以拉平基线，从而解决这个问题。使用更长的波长检测，如254 nm，也可以解决这个问题，但并非任何情况下都适用。这是我们所希望看到的梯度分析的结果insert gradient_sep_of _pep -tides.gif这显示了典型的梯度洗脱不同分子量大小的多肽类/蛋白质类组分的状况。流动相A中含0.1% 的TFA，流动相B中含0.085%的 TFA。其结果是基线水平，不仅看起来更好，且更有助于数据积分。 当然，您将常会碰到基线漂移很小而影响不大的情况，尤其是如果此时当您的色谱峰大小不变并且可以

18、准确积分的话，那就没有什么关系。Mike：好。现在让我们一起来谈谈延迟体积吧的问题。 Rita：听起来很不错。基线漂移是梯度洗脱中常见的问题。它通常与流动相及其紫外吸收有关。在许多应用中，理想的情况是流动相A和B中缓冲盐或改性剂的浓度相同。当使用TFA时，尝试溶剂A中用0.1% 的TFA，溶剂B中用约0.09%的 TFA。滞后延迟体积Mike：那么，什么是延迟体积呢？ 对于高压混合系统，延迟体积等于从溶剂在两个计量泵后相遇混合点到柱头流经的所有体积之和。对于低压混合系统，show dwell volum -e .gif延迟体积等于从比例阀经过泵到柱头流经的所有体积之和。对于梯度分离，延迟体积实

19、际上使梯度开始时进行了一段时间的等度洗脱，这个时间等于延迟体积除以流速。过大的延迟体积会使一些仪器不能使用窄径色谱柱进行梯度分离。较大的延迟体积不会影响等度分离，除了改变流动相时，平衡色谱柱需花费更长的时间。当使用窄径色谱柱时，仪器配置是至关重要的。使用窄径（2.1 mm ID）和微径（1 mm， 和<1 mm ID）色谱柱进行梯度洗脱分析条件优化时，为了得到最佳的结果，必须将延迟体积和柱外体积最小化。Rita：因此即使是很小延迟体积的差异都可以改变分离度。Mike：是的, 它们当然会。在这张幻灯片show gradient_ example1中，我们可以看到分离一个复杂混合物的模拟梯度

20、分析色谱图。上图是LC分离中实际数据的模拟。将色谱峰的保留时间输入DryLab软件，仪器实际的延迟体积为0.43 mL。分析使用配有二元泵的Agilent 1100 LC系统，未启用混合器。下图系使用延迟体积为2.0 mL的仪器代替延迟体积为0.43 mL的仪器进行相同分离后的模拟色谱图。您可以看到在某仪器上两个本可以完全分离的色谱峰，在有较大延迟体积的仪器上却会共一起流出。point to second lower hyphenated peak在梯度分离中，不同的延迟体积会改变峰宽和相对保留时间。建立梯度洗脱方法时，测试不同延迟体积对分析结果的影响是非常明智的！一些仪器调整延迟体积时具有很

21、大的灵活性。我们有时使用这样的系统去模拟各种不同的HPLC配置，因为LC主要的区别之一就是延迟体积的不同。insert dwell volume_ compare iso n.gif现在您可以看到在同一个系统上，同一个样品的四张不同的梯度分析谱图。它们的梯度时间程序是相同的，但仪器可以经过重新配置以实现了设定更宽范围的延迟体积。我们可以看到，在这些特殊设置的色谱条件下，在最大的和最小的延迟体积时均出现了分辨率问题。这表明最初的方法开发应在中等延迟体积条件的仪器上进行。为使此方法可在四种配置的仪器上均正常运行，我们需要调整梯度程序并再次运行测试。 延迟体积等于从溶剂在两个计量泵后相遇混合点到柱头

22、流经的所有体积之和。 对于低压混合系统，延迟体积等于从比例阀经过泵到柱头流经的所有体积之和。延迟体积实际上使梯度开始时运行了一段时间的等度洗脱，这个时间等于延迟体积除以流速。在梯度分离中，延迟体积的差异会改变峰宽和相对保留时间。延迟体积对方法耐用性的影响梯度分离 让我们一起来看一个关于延迟体积的LC故障排除的实例。请看这张色谱对比图 。insert dwell_volume _comparison2.jpg注意早期流出的峰较宽。这是由于延迟体积造成早期的峰实际流出较晚实质上它们是以等度洗脱的方式流出的。如果这干扰了分离或检测的结果，我们需要减小延迟体积或将此应用移至另一个系统。当建立梯度分离方

23、法时，重要的是您首先要测量并记录您所使用仪器的延迟体积。了解当将梯度方法转移到其它仪器和实验室时，明确延迟体积的差异是很重要的。我们在视频记录中提供了仪器延迟体积的直接测量方法，您可以登陆安捷伦网站搜索“Gradient Video Notes（梯度洗脱视频记录）”或在视频播放器中点击“get notes（获得记录）”按钮找到它。这里还有几种测量延迟体积的方法供您选用。现在我将为您演示其中的一种。demo首先，准备一张整版横向输出打印有梯度步骤变化曲线的纸，或者像我们这里所做的，将图像复制粘贴到Powerpoint（幻灯片）中。insert calculate1. gif back to Mi

24、ke, with ruler and printout使用尺子在纸上或在Powerpoint（幻灯片） 中插入线段，在如下位置处绘制与x或y轴平行的线：1. 0%B区域信号为零处2. 100%B区域最大稳定信号处3. 在2.0 min处绘制一条垂直线您得到的图像看起来像这张图片 insert calculate2.gif三条线绘制完毕后，再绘制另外两条线：4. 计算这一步50%处的响应值 ，在本例中应为24.5 mAU，在该位置绘制一条穿过图形的水平线5. 在50%响应值与实际的检测信号的交点处绘制一条垂直线您得到的新图应该像下面的这张幻灯片中所示。 insert calulate3.gifs

25、how on printout, pointing, as describing 测定沿x轴方向，至50%B垂直线交点的时间，应尽可能接近该点的精确，在该时间点处得到50%响应值即实测值。在延迟体积的估算中，0.1 min的误差将会导致50 µL的误差。在本例中，我们估算50%的时间为4.04 min。关于延迟体积的计算，一个简单的公式是 时间 (50%响应值处) 时间(步长) x 流速 = 延迟体积那么在本例中的延迟体积就应为(4.04-2.00) min x 500 µL/min = 1020 µL。该测定在Agilent 1200 RRLC系统（1200SL

26、）上运行，表观背压340 bar，通过一个额定的100 cm，0.062 mm (0.0025英寸) i.d. PEEK限流器。用水做特定的溶剂在液流输运过程中进行可压缩性补偿。这个系统的正常流路中包括了标准混合器、脉冲阻尼器和一个正常流路中运行的自动进样器（与旁路模式相比对照），与以及上面提到的限流器相连，并配备有3 mm 2 µL的流通池。Rita：为了探查考察延迟体积对梯度分离的影响，您必须在梯度运行开始时，增加或减少等度洗脱的时间。如要在较小延迟体积的系统上模拟较大的延迟体积，您可在梯度程序开始时设置一个保持时间，这个时间等于这两个延迟体积的差值（mL）除以流速（mL/min

27、）。模拟比您当前的仪器小的延迟体积时，您必须调整进样器程序，延迟进样时间，延迟的时间等于滞后时间。有些仪器有这个功能，有些仪器没有。最后，在您编写的方法中，记录下方法建立时仪器的延迟体积及其对分离的任何影响是非常重要的。 了解当将梯度方法转移到其它仪器和实验室时，明确延迟体积的差异是很重要的。自动进样器程序辅助梯度洗脱优化Mike：延迟体积同样也包括进样器体积，所以减小进样器内体积及其周围连接管路的体积是很重要的。大多数Agilent自动进样器提供旁路运行模式的选项，样品从样品环中被冲出后，进样器再转回到载样位置demo。依据您现在使用的自动进样器类型，系统体积最多可减少300 µL。一个标准的Agilent仪器原始的延迟体积约为1100 µL，通