葡萄酒中的氨基甲酸乙酯1

1、顶空液相微萃取/气相色谱-质谱检测葡萄酒中的氨基甲酸乙酯姜自军1,2，阎雪1,2* 基金项目：吉林省质量技术监督局科技计划项目（2010ZJK07）作者简介：姜自军（1963），男，高级工程师，主要从事食品生产许可证审查工作。E-mail：通讯作者：阎雪(1979)，女，吉林省通化人，研究生，主要从事食品中挥发性、半挥发性有机物检测的研究与应用。E-mail：，电话：，单纪平1,2，徐刚1,2，慈慧2（1.国家果酒及果蔬饮品质量监督检验中心，吉林 通化 134001；2.通化市产品质量检验所，吉林 通化 134001）摘要：建立了顶空液相微萃取/气相色谱仪-质谱联用测定葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的

2、方法。对影响萃取效率的实验条件进行了优化。采用Rtx-Wax毛细管柱进行检测，以癸烷为萃取溶剂，在60、搅拌速度为200r/min条件下对1mL葡萄酒样品萃取30min。该方法对氨基甲酸乙酯的富集倍数为62；在1001600 µg/L的范围内线性关系良好。相关系数为0.9999；氨基甲酸乙酯的检出限为1µg/L（S/N=3）。实际酒样的加标回收率为81.0%103.1%。关键词：顶空液相微萃取；葡萄酒；氨基甲酸乙酯；气相色谱仪-质谱Applied the method of headspace liquid-phase micro-extraction coupled wi

3、th gas chromatography-mass spectrometry to the determination of ethyl carbamate in winesJIANG Zi-jun1,2, YAN Xue1,2*, SHAN Ji-ping1,2, XU Gang1,2, CI Hui2(1. National ratafia and fruits and vegetables drinks quality surveillance test center, Tonghua 134001, China2. Tonghua manufactured product quali

4、ty surveillance test institute, Tonghua 134001, China)Abstract：Headspace liquid-phase micro-extraction (HS-LPEM) coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to determine the ethyl carbamate of wines. Some main experimental parameters that affect the extraction efficiency were

5、optimized. Decane was selected as extraction solvent. The extraction was carried out at 60 in a 2mL vial filled with 1mL of sample solution at a stirring rate of 500r/min for 30min. The enrichment factors for the ethyl carbamate was 62. The linear range for the quantification of the ethyl carbamate

6、was 1001600 µg/L(R2=0.9999) . The limit of detection was 1µg/L（S/N=3）for the ethyl carbamate. Recovery was 81.0%103.1%.Key word: headspace liquid-phase micro-extraction(HS-LPEM)；wines；ethyl carbamate；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC) 又名尿烷，是发酵食物和酒精饮品在发酵或贮

7、存过程中天然产生的污染物，包括葡萄酒在内的发酵饮料和食品中含有的微量氨基甲酸乙酯早在1943年就被证实是一种致癌物质。加拿大和美国的卫生与预防部门规定佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超过30g/L和15g/L1。目前我国尚未对葡萄酒中的EC作出限量标准2。目前，葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的萃取方法有液/液萃取、固/液萃取、固相微萃取及固相萃取柱萃取等几种，但是以上方法各有其缺点和不足3。液/液萃取法用于葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的定量检测, 提取效率很高，但是有机溶剂用量大，容易对环境造成二次污染，而且大部分萃取溶剂都是有毒的，对实验人员的身体伤害比较大；固/液萃取，固相萃取柱萃取仍然要使用较多的有

8、机溶剂；固相微萃取法无需有机溶剂、所需样品量少，灵敏度高，重现性号，操作简单、快捷，但是由于萃取纤维重复使用，存在目标物残留的问题4-5。机溶剂都液相微萃取技术（LPME）是在液-液萃取(LLE)的基础上发展起来的，在1996年由Jeannot和Cantwell提出的。LPME技术灵敏度高，富集效果好，同时集采样、萃取和浓缩于一体，灵敏度高，操作简单，而且还具有快捷，廉价等特点。另外，该技术仅需几到几十微升的有机溶剂，是一项环境友好的样品前处理新技术，特别适用于挥发性，半挥发性有机物的测定6-11。1.实验部分1.1仪器与试剂样品气相色谱-质谱联用仪（岛津GCMS-QP2010,日本岛津公司）

9、，微量进样器（10L,美国hamilton公司）。氨基甲酸乙酯（98.5%，德国产）氨基甲酸丙酯（98.0%，德国产）癸烷（99.5%，德国产），十二烷（99.0%，德国产）辛烷（99.0%，天津产）甲苯（99.9%，天津产）乙酸乙酯（99.8%，天津产）正辛醇（99.5%，德国产）葡萄酒样品为不同葡萄酒厂取得的原酒和成品酒。1.2.GC-MS分析条件岛津气相色谱-质谱联用仪（GCMS-QP2010）；30 m×0.25 mm×0.25µm Rtx-Wax毛细管柱；进样口温度为250；载气(He)流速1.0 ml/min；柱箱起始温度为80，然后以20/min的速

10、度升温到250，保持1.5 min。不分流进样。分析时间为10 min。离子源温度200；接口温度220；电离方式El；选择离子模式SIM；电离能量70 Ev；切割溶剂时间4.0 min。检测离子m/z 62、44、74，定量离子m/z 62。1.3. 顶空液相微萃取顶空液相微萃取包括以下几个步骤： (1) 按照图1所示组装液相微萃取装置 (2) 取一支干净的10 µl 色谱进样针用萃取溶剂清洗至少20次，以确保针筒和针尖内没有气泡残留 (3) 用进样针吸2.6 µL 萃取溶剂，针尖穿透样品瓶的隔垫，小心按下进样器的活塞，使溶剂悬于针尖，在样品上空1 cm 处形成一个小液滴

11、 (4) 接通电源，搅拌样品溶液，萃取30 min，确保水浴的温度始终控制在60 (5) 收回萃取溶剂液滴到进样针内，并将针移出样品瓶，直接进GC-MS进行分析。图1 HS-LPME 示意图 1. 色谱进样针；2. 有机溶剂液滴；3. 样品溶液；4. 磁力搅拌子；5. 磁力搅拌器；6.水浴Fig.1 Schematic diagram of the HS-LPME apparatus 1.Micro syringe; 2.Extracting solvent; 3.sample; 4.magnetic muddler; 5.magnetic stirrer; 6.water heater2.结

12、果与讨论2.1色谱条件的测定本实验考虑了色谱柱的影响，采用30 m×0.25 mm×0.25µm Rtx-Wax毛细管柱和30 m×0.25 mm×0.25µm Rtx-5MS毛细管柱进行分析，对分析结果进行了比较。Rtx-5MS毛细管柱几乎不出峰。因为EC和PC是属于极性较强的酯类。所以最后实验选择使用Rtx-Wax毛细管柱进行分析，得到如图二的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的色谱图及如图三的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的质谱图。图二 氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的GCMS色谱图Fig.2 Chromatogram of ethyl car

13、bamate and propyl carbamate by GCMS图三 氨基甲酸乙酯和氨基甲酸丙酯的质谱图Fig.3 Mass spectrum of ethyl carbamate and propyl carbamate by GCMS2.2 LPME条件的优化2.2.1萃取溶剂的选择萃取溶剂在液相微萃取中是至关重要的影响因素。本实验考察了癸烷、甲苯、正辛醇三类溶剂对氨基甲酸乙酯的萃取效率。分别在室温，搅拌速度为200r/min的条件下萃取30min。从实验结果上看，甲苯和正辛醇在氨基甲酸乙酯的出峰时间内对其有干扰。又对十二烷、癸烷、辛烷的萃取效果进行了比较，十二烷在氨基甲酸乙酯的出峰

14、时间内对其有干扰，辛烷在萃取时挥发的比较多，中间的萃取过程很难控制。故确定癸烷为萃取溶剂。2.2.2萃取温度的影响萃取温度是影响分析物分布平衡的一个重要因素，升高温度有助于分析物从基体中脱离出来，也有利于提高分析物的扩散速度，从而提高分析速度。本实验研究温度从30到80范围内对萃取效率的影响。结果表明，温度在60以后萃取效率的变化不大，因此本实验采用60作为萃取温度。2.2.3萃取时间的选择本实验考察了萃取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min时对EC萃取效率的影响。实验结果表明，萃取时间越长萃取效率越高。但是考虑到实验的实际情况，最终选择了30min

15、作为萃取时间。2.2.4搅拌速度的影响在液相微萃取过程中，搅拌样品，有利于氨基甲酸乙酯的挥出，可缩短达到萃取平衡的时间，从而提高萃取效率。但是如果搅拌速度过快，2mL样品瓶内的样品会产生很大的涡旋，影响萃取过程中悬挂液滴的稳定性。因此，考察了搅拌速度从0500r/min时对萃取效率的影响。最后确定搅拌速度为200r/min。2.2.5样品溶液PH值的影响本实验研究了PH值从酸性、中性、碱性范围内对萃取效率的影响。结果表明，PH值对EC萃取效率影响不大。因此样品溶液未作PH值的调整。2.3 线性范围、检出限和富集倍数用丙酮配置EC+PC的浓度分别为100+300、200+300、300+300、

16、800+300、1600+300 µg/L的标准溶液（PC为内标）。用“1.3”节的实验条件进行萃取、测定。得到如图四的标准曲线。在所测定的浓度范围内EC的线性关系良好。相关系数为R2 = 0.9999。EC的检出限为1µg/L（S/N=3）富集倍数为62。图四 内标法标准曲线Fig.4 Standard curve of internal standard method2.4 实际葡萄酒样品及加标回收率的测定按照实验方法对未经处理的11个实际葡萄酒样品进行液相微萃取、测定。测得氨基甲酸乙酯的含量在5.056.1 µg/kg之间。 3. 结论葡萄酒中氨基甲酸乙酯含

17、量问题已经引起了世界各国的普遍关注，当前迫切需要对我国葡萄酒中的EC限量及降低其含量。本实验建立了顶空液相微萃取/气相色谱仪-质谱联用技术测定葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的方法。可快速、灵敏地分析葡萄酒样品中的氨基甲酸乙酯含量。同时，本实验的方法为在酿造过程中产生的EC含量的检测提供了依据。也为进一步研究在发酵过程中减少EC的方法研究提供了方法支持。参考文献：1 Canas B J, Joe F L, Diachenko GW, et al. Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages and soy sauce bv chroma

18、tography with mass selective detection：collaborative study JJournal of AOAC International，1994，77：153015362 中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检验方法S3 梁新红，赵功玲. 酒精饮料中氨基甲酸乙酯分析前处理技术研究进展J, 中国酿造，2009. 8:144 阎雪，姜自军. 顶空液相微萃取/气相色谱-质谱在葡萄酒风味组分检测中的应用J. 中国食物与营养，2011. 17(7); 51555 Yan X, Yang C, Li DH, et al. Import

19、ance of extracting solvent vapor pressure in headspace liquid-phase microextractionj. Journal of Chromatography A, 2008, 1205:1821856 Deng C, Yao N, Wang A, et al. Determination of essential oil in a traditional Chinese medicine, Fructus amomi by pressurized hot water extraction followed by liquid-phase microextraction and gas chromatographymass spectrometryJ. Analytica Chimica Acta, 2005.536(1): 2372447 Chen Y I, Su Y S, Jen J F. Determination of dichlorvos by on-line microwave-assisted extraction coupled to headspace soli