水解酶的催化多功能性和串联方法的研究论文

1、 .硕 士 学 位 论 文论文题目: 水解酶的催化多功能性与其串联方法的研究作者 香 指导教师 林 贤 福 教 授 学科(专业) 应 用 化 学 所在学院 理 学 院 提交日期 2011 年 1 月 107 / 120硕士学位论文水解酶的催化多功能性与其串联方法的研究作 者： 香导 师：林贤福 教授二一一年一月中国 M. S. DissertationStudy on the Catalytic Promiscuityof Hydrolase and Tandem Reaction Author: Xiang ChenAdvisor: Prof. Xianfu Lin Chemistry De

2、partment, Zhejiang UniversityJan 2011HangzhouChina附件3：独创性声明与版权使用授权书独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作与取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示意。 学位论文作者签名： 签字日期：学位论文使用授权书本学位论文作者完全了解 大学 有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复

3、印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学 可以将学位论文的全部或部分容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： ： 通讯地址： ：摘要酶催化有机合成方法的研究越来越受化学家关注，探索酶催化的新功能，调控酶促反应，通过酶催化多功能性来设计串联反应新方法新途径；为化学的绿色合成提供更有价值的新思路、新技术。论文研究了脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反应的新功能，考察了反应条件，包括反应时间、酶源、溶剂、底物的比例

4、、酶浓度、温度、底物结构对脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反应的影响，合成了15种吲哚衍生物。并通过无酶，BSA与失活的PPL来验证酶活性中心的催化作用，提出了可能的催化机理。论文研究了脂肪酶催化的亲核加成-消去-Michael加成串联反应的新功能，考察了酶源、反应介质、混合溶剂的比例、酶浓度、温度、反应时间、底物结构对脂肪酶催化该串联反应的影响，结果表明：在水与二氧六环比例为4/1的混合溶剂中，脂肪酶PPL可以催化醛与吲哚的串联反应，合成了26种双分子吲哚衍生物。论文研究了N-杂环化合物添加对酶促反应的调控作用。发现当酶与咪唑质量比为2/1时，酰化酶的催化Claisen-Schm

5、idt活性显著提高。并通过无酶无咪唑、BSA和咪唑、单酶与单咪唑催化来证实酶活性中心和咪唑的共同的催化作用，提出了可能的催化机理。同时考察了酶源、溶剂、添加剂、反应时间、底物结构对酰化酶与咪唑催化反应的影响；并合成了18种, -不饱和羰基化合物。论文通过调控酰化酶与咪唑共同催化催化芳香醛与酮的Aldol缩合-消去-Michael加成-分子Aldol缩合-消去串联反应活性，合成了15种新颖的环己烯酮衍生物。考察了反应条件：酶源、溶剂、添加剂、酶与添加剂的比例、底物结构对酰化酶与咪唑催化串联Aldol缩合-消去-Michael加成-分子Aldol缩合-消去反应的影响，并提出了可能的反应机理。本论文

6、总共合成了74种化合物，产物经IR，1H-NMR, 13C-NMR，GC-MS，HRMS等手段表征分析和验证。关键词：脂肪酶、酰化酶、串联反应、多功能性、共同催化。AbstractEnzyme catalysis in organic synthesis had drawn an increasing number of chemists attention. Explore new function of enzymes; regulate enzymatic reaction; design a new tandem reaction base on the promiscuity of

7、enzym, providing more valuable, new ideas and new technologies for green chemistry.Lipase was firstly found to catalyze the Friedel-Craft reaction in water. After screening the reaction time, enzyme sources, reaction media, the molar ratio of substrate, temperature and the structure of substrates, l

8、ipase fromporcine pancreas, Type II (PPL) catalyzed the Friedel-Craft reaction of indole derivative and , -unsaturated compounds. 15Fridel-Craft adducts were synthesized.Thecontrol experiments proved that the active site of PPL were responsible for those enzymatic reaction. The mechanisms for the Fr

9、iedel-Craft reaction and tandem reaction catalyzed by PPL werealso proposed.We screening the PPL catalyze the tandem Nucleophilic addition/dehydration /Michael addition of aldehyde and indole. The enzyme sources, reaction media, temperature, the structure of substrate that affects this tandem reacti

10、on were investigated systemly. In mixture solvent (water/dioxane=4/1), lipase (from porcine pancreas, Type II) can catalyze the tandem Nucleophilic addition/dehydration /Michael addition between aldehydes and indole derivatives. After the stepwise process were optimized, 26 bis(indolyl)alkanes were

11、prepared in moderate to excellent yields by using PPL as catalyst.The influence of N-heterocyclic compounds on the enzymatic reaction was investigated. Though investigating enzyme sources, solvent, additive, the ratio of imidazole and acylase, we found D-aminoacylase and imidazole can co-catalyze th

12、e Claisen-Schmidt reaction. When the ratio of D-aminoacylase and imidazole is 2/1, the activity of D-aminoacylase was improved obviously. And 18 tandems Aldol condensation/dehydration adducts were obtained via this method. Thecontrol experiments demonstrated that the active site of D-aminoacylase wa

13、s responsible for theenzymatic reaction. The mechanism for the Claisen-Schmidt reaction catalyzed by D-aminoacylase and imidazolewasalso proposed.A single enzyme can co-catalyze the cascade Aldol condensation-elimination -Michael-intromolecularAldolcondensation-eliminationfor synthesis of conjugate

14、cyclohexanone-2-ene reaction with imidazole in octane. By investigating enzyme sources, solvent, additive, the ratio of imidazole and acylase, we found D-aminoacylase and imidazole can co-catalyze this tandem reaction. After the stepwise process was optimized, 15 conjugate cyclohexanone-2-enes were

15、prepared. Some control experiments were designed to prove that the enzyme canco-catalyze this cascade reaction with imidazole in octane. The mechanism for the tandem reaction catalyzed by D-aminoacylase and imidazolewasalso proposed.In this thesis, 74 compounds were synthesized and these compounds w

16、ere characterized by IR, 1H NMR, 13C NMR, GC-MS andHRMS.Keywords: lipase; acylase;tandem;multifunction;co-catalyze.目录独创性声明i摘要iiAbstractiii第一章 绪论11.1 酶催化多功能性的研究11.2 酶催化多组分串联反应11.3 小分子对酶促反应的调控21.4 本论文的研究目的与容2第二章 酶催化多功能性与酶催化串联方法研究进展42.1 酶的催化多功能性42.1.1 脂肪酶的催化多功能性42.1.2 蛋白酶的催化多功能性72.1.3 酰化酶催化加成反应72.1.4 酯

17、酶催化氧化反应92.1.5 转氨酶的催化多功能性102.1.6 其他酶的催化多功能性102.2 酶促串联反应112.2.1单酶催化串联反应122.2.2 多酶催化串联反应142.2.3化学/酶促法催化串联反应182.3小分子对酶的催化的调控222.3.1小分子对酶促化学选择性调控222.3.2小分子对酶的区域选择性调控232.3.3小分子对酶的立体选择性调控24第三章 水解酶催化Friedel-Craft反应与其串联反应303.1 实验部分303.1.1 实验试剂303.1.2 实验仪器与方法313.1.3 合成Friedel-Crafts产物的表征323.1.4 合成双分子吲哚衍生物的表征3

18、53.2脂肪酶催化Friedel-Craft反应393.2.1引言393.2.2 水解酶催化Friedel-Crafts烷基化反应403.2.3 酶源对Friedel-Crafts烷基化反应的影响413.2.4 脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反应的条件优化423.2.5脂肪酶催化合成氮杂环衍生物443.2.6脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反应机理模型473.3 脂肪酶催化醛与吲哚衍生物的串联反应483.3.1引言483.3.2 水解酶催化双分子吲哚与醛的串联反应483.3.3 酶源对吲哚与对硝基苯甲醛串联反应的影响503.3.4 反应条件对水解酶催化吲哚与醛串联反应

19、的影响503.3.5脂肪酶催化合成氮杂环衍生物533.3.6脂肪酶催化合成氮杂环衍生物机理模型563.4 本章小结58第四章 D-氨基酰化酶与N-杂环催化Claisen-Schmidt反应614.1引言614.2 实验部分624.2.1 实验试剂624.2.2 实验仪器与方法634.2.3 咪唑与D-氨基酰化酶催化Claisen-Schmidt反应644.3酶源对Claisen-Schmid反应的影响684.4酰化酶与N-杂环化合物催化Claisen-Schmidt反应的条件优化684.4.1 有机溶剂对Claisen-Schmidt反应的影响694.4.2 添加剂对Claisen-Schmi

20、dt反应的影响694.4.3 添加剂与酶的比例对Claisen-Schmidt反应的影响704.4.4 反应时间对Claisen-Schmidt反应的影响714.4.5 优化后的酰化酶催化Claisen-Schmidt反应条件724.5 N-杂环化合物调节酰化酶催化合成, -不饱和羰基化合物724.5.1受体结构对Claisen-Schmidt反应的影响724. 5.2供体结构对于Claisen-Schmidt反应的影响734.6 酰化酶与咪唑催化Claisen-schmidt反应的机理744.6.1 酶活性中心催化验证744.6.2 反应机理754.7 本章小结76第五章 酰化酶催化醛酮多步

21、串联合成环己烯酮衍生物785.1引言785.2 实验部分795.2.1 实验试剂795.2.2 实验仪器与方法805.2.3 D-氨基酰化酶与咪唑催化串联反应合成环己烯酮衍生物815.2.4 合成化合物的表征835.3 催化剂对醛酮串联反应的影响865.3.1酶源对醛酮串联反应的影响865.3.2 添加剂对醛酮串联反应的影响875.4 试验条件对该串联反应的影响875.4.1 有机溶剂对醛酮串联反应的影响875.4.2 丙酮的量对醛酮串联反应的影响885.4.3 添加剂与酶的比例对醛酮串联反应的影响885.4.4 优化后的酰化酶催化醛酮串联反应的条件895.5 N-杂环化合物调节酰化酶催化合成

22、环己烯酮衍生物905.5.1受体结构对醛酮串联反应的影响905. 5.2供体结构对醛酮串联反应的影响915.6 酰化酶与咪唑催化醛酮串联反应的机理假设925.6.1 酶活性中心催化验证925.6.2 反应机理925.7 本章小结93第六章 总结95攻读硕士学位期间发表的论文97致 98第一章 绪论酶作为一种高效的、对环境友好的催化剂已经越来越广泛地应用于有机合成1a-f。对酶促反应的研究也逐渐转变为酶促的多功能性和调控酶促反应。酶促一锅法和酶促串联反应也逐渐成为研究的热点。1.1 酶催化多功能性的研究酶的催化多功能性在最近十年研究的新进展，Berglund和 Gotor等人分别报道了脂肪酶CA

23、L-B具有催化碳-碳键2和碳-氮键Michael3加成反应新功能。Kita、Hult和余孝其课题组又发现水解酶除催化酯键或者酰胺键的合成与水解外，还可以催化胺解反应4、羟醛缩合反应5a-b、Diels-Alder6和Mannich 7等；我们课题组也发现碳-氮键Michael8a-b加成反应可以被蛋白酶、D-氨基酸酰化酶等水解酶催化、碳-碳Michael9加成反应也可以被D-氨基酸酰化酶催化、氮杂环与乙烯酯的Markovnikov10a-c加成反应可以被酰化酶PGA、D-氨基酸酰化酶和Amano Acylase催化、醛与硝基烷烃的Henry11反应也可以由D-氨基酸酰化酶催化等一系列新现象。不

24、断研究探索酶催化多功能性的机理，深入认识酶催化的性质，这将大大促进酶催化方法在绿色有机合成中应用。1.2 酶催化多组分串联反应串联反应可以实现从简单的原料出发合成复杂的功能分子，酶联合化学催化剂来催化串联反应是个非常具有挑战性方法。Kroutil12课题组利用金属与酶的的组合来实现串联的氧化与非对称还原反应。Huerta课题组13报道了-羟基酯化合物的动力学拆分可以通过脂肪酶Pseudomonas cepacia和钌催化剂的组合来实现，得到较高的产率和ee值。酶促化学法即可以实现动态动力学拆分14a-c，又可以用于手性合成15a-b。利用酶具有催化多种反应的功能，以多步串联和一锅转化的方式来实

25、现多种生物活性化合物合成，这对有机合成方法学具有重要的意义。余孝其课题组报道了水解酶可以催化Mannich16反应，脱羰基的aldol17反应等。Klaas18课题组报道了水解酶CAL B可以催化脱保护，酰基化和环氧化的多步串联反应。我们课题组也利用单酶催化合成一系列含糖咪唑衍生物19与复杂的咪唑-糖类复合物。在利用串联来合成碳水类方面，多酶已经展现出很大的优势和潜力。Ragauskas和Witayakran20也报道了苯并呋喃衍生物可以通过双酶体系来合成。Wong21课题组与Richter22课题组通过控制各步反应条件，利用多酶催化的功能来合成多种糖类衍生物。酶催化串联反应具有条件温和，环境

26、友好等优势。因而，利用单酶或多酶来探索新反应的组合将会是一个新的领域。1.3 小分子对酶促反应的调控酶的结构决定了酶的催化功能，一些酶与小分子存在着特殊的作用，从而能引起蛋白构象的变化，添加剂的使用能够调节酶催化的功能23,例如：化学选择性调控、立体选择性调控和区域选择性调控。利用添加剂调控酶促反应，是基因工程之外新途径，为推动酶催化合成的应用提供更加可行办法。1.4 本论文的研究目的与容本论文的研究目的是：通过研究酶的催化多功能性，认识酶催化本质，实现调控酶促反应，并应用于有机合成。为此，论文将围绕以下容开展研究。研究了脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反应的新功能，考察了反应条件

27、，包括反应时间、酶源、溶剂、底物的比例、酶浓度、温度、底物结构对脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反应的影响。同时还发现了脂肪酶具有催化串联的亲核加成-消去-Michael加成反应的新功能，考察了酶源、反应介质、混合溶剂的比例、酶浓度、温度、反应时间、底物结构对脂肪酶催化该串联反应的影响。并通过无酶，BSA与失活的PPL来验证酶活性中心的催化作用，提出了可能的催化机理。研究N-杂环化合物对酰化酶催化多功能性的调控作用，考察酶源、有机溶剂、各种N-杂环化合物、N-杂环化合物与酰化酶的比例、催化剂的量、反应时间等因素对酶催化功能的影响。建立添加剂与酶催化功能的关系，并将添加剂的调控作用应

28、用于酰化酶催化Claisen-Schmidt和串联的Aldol缩合-消去-Michael加成-分子Aldol缩合-消去反应。通过控制实验来验证酶与添加剂共同起到催化作用，提出了反应的机理。参考文献1. (a) R. J Kazlauskas, Curr. Opin. Chem. Biol.,2005, 9, 195; (b) P Berglundand SPark, Curr. Org. Chem.,2005, 9, 325; (c) D. M. Z Schmidt, E. CMundorff,MDojka, E Bermudez, J. ENess, S Govindarajan, P. C

29、Babbitt, J Minshull and J. AGerlt, Biochemistry,2003, 42,8387; (d) O Khersonsky, CRoodveldt and D. STawfik, Curr. Opin.Chem. Biol.,2006, 10, 498; (e) G. HDijoux, M. MElenkov, J. H. LSpelberg, B Hauer and D. BJanssen, ChemBioChem.,2008, 9, 1048; (f) R Kourist, SBartch, L Fransson, K Hult and U. T Bor

30、nscheuer,ChemBioChem.,2008, 9, 67.2. M Svedendahl, K Hult, P Berglund. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 17988. 3. O Torre, I Alfonso, V Gotor. Chem. Commun.2004, 1724. 4. I Alfonso, V Gotor. Chem. Soc. Rev. 2004, 33, 201. 5. (a) S Akai, K Tanimoto, Y Kita. Angew. Chem. Int. Ed.2004, 43, 1407; (b) Ch Li,

31、 X.W Feng, N Wang, Y. J Zhou and X. Q Yu, Green Chem., 2008, 10, 616.6. C Branneby, P Carlqvist, A Magnusson, K Hult, T Brinck, P Berglund. J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 874. 7. K Li, T He, Ch Li, X. W Feng, N Wang and X. Q Yu, Green Chem., 2009, 6, 777.8. (a) Y Cai, X. F Sun, N Wang, X. F Lin. Synthe

32、sis, 2004, 671; (b) Qian C, Xu J M, Wu Q, Lv D S, Lin X F. Tetrahedron Lett.2007, 48, 6100. 9. J M. Xu, F Zhang, B K. Liu, Q Wu, X F. Lin. Chem. Commun.2007, 2078. 10. (a) W B. Wu, N Wang, J M. Xu, Q Wu, X F. Lin. Chem. Commun.2005, 2348;(b) W B. Wu, J M. Xu, Q Wu, D S. Lv, X F. Lin. Adv. Synth. Cat

33、al.2006, 348, 487;(c) W B. Wu, J M. Xu, Q Wu, D S. Lv, X F. Lin. Synlett 2005, 2433. 11. J. L Wang, X Li, H. Y Xie, B. K Liu, X. F Lin, Journal of Biotechnolgy, 2010, 145, 240.12. F G. Mutti,A Orthaber,J H. Schrittwieser,J G. Vries,RPietschnigand W Kroutil. Chem. Commun., 2010, 46, 8046.13. F F. Hue

34、rta, Y R S. Laxmi, J E. Backvall. Org. Lett., 2000, 2, 1037.14. (a) A N. Parvulescu, P A. Jacobs, D E. De Vos. Adv. Synth. Catal. 2008, 350, 113; (b) M Krausser, W Hummel, H Groger. Eur. J. Org. Chem. 2007, 5175; (c) E Burda, W Hummel, H Groger. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9551. 15.(a)F Zheng, W

35、 C. Yang, M C. Ko, J J. Liu, H Cho, D Q. Gao, M. Tong, H H. Tai, J H. Woods, C G. Zhan. J. Am. Chem. Soc.2008, 130, 12148;(b)G J. Williams, T. L Woodhall, M Farnsworth, A Nelson, A Berry. J. Am. Chem. Soc.2006, 128, 16238.16. K Li, T He, Ch Li, X. W Feng, N Wang and X. Q Yu, Green Chem., 2009, 6, 77

36、7.17. X W. Feng, Ch Li, N Wang, K Li, W W. Zhang, X Q. Yu. Green Chem., 2009, 11, 1933.18. M. Rusch gen Klaas, M. Kunz, S. Warwel, J. Mol. Catal. B: Enzym., 1999, 7, 283.19. S P. Yao, D S. Lu, Q Wu, Y Cai, S H. Xu, X F. Lin. Chem. Commun.2004, 2006. 20.S Witayakran, A J. Ragauskas. Eur. J. Org. Chem

37、.2009, 3, 358. 21. D Franke, T Machajewski, C C. Hsu, C H. Wong. J. Org. Chem.2003, 68, 6828. 22. W Rmisch, W Eisenreich, G Richter, A Bacher.J. Org. Chem.2002, 67, 8890. 23.(a) T Itoh, S H. Han, Y Matsushita, S Hayase. Green Chem.2004, 6, 437; (b) W Y. Lou, M H. Zong, H. Wu, R. Xu, J F. Wang. Green

38、 Chem.2005, 7, 500.第二章 酶催化多功能性与酶催化串联方法研究进展生物催化合成方法是当前备受关注的前沿领域1a-c。它具有选择性高、条件温和、反应速度快等优点，因而吸引了化学、化工、制药、材料等众多领域研究学者的兴趣。酶一直被认为是一种快速、专一且只对一定底物或一类反应具有高度识别的生物催化剂。越来越多具有高立体选择性的酶被广泛应用于多种有机化合物的合成中2a-c。最近的研究表明部分酶还具有催化多功能性，即许多酶能够在主反应的活性位点催化第二种反应，而且越来越多的研究表明催化多功能性普遍存在。串联反应可以由简单原料经过多个化学键形成来得到目标产物。该方法减少中间产物的分离步骤

39、，简化反应操作的过程。同时也能防止活泼或不稳定中间产物在反应体系中的累积，加快反应速度，提高最终产物的得率，进而得到一些常规方法难以合成的化合物。与分步反应相比, 巧妙的串联反应不仅能提高反应效率，具有高选择性、原子经济性,大量减少浪费，还能免去了各步后处理和分离带来的消耗和污染。本章主要针对酶的催化多功能性研究、小分子调控酶促混乱性的研究以与单酶参与的串联反应在有机合成中的应用与化学/酶促法催化串联反应。2.1 酶的催化多功能性酶的催化多功能性是指酶在其活性位点能够催化不同化学反应的能力，这些化学反应可能在两点上有所不同：(1)参与的官能团，即反应过程中形成或断裂的键不同；(2)可能的催化机

40、理，即键形成或断裂的过程不同。大多数催化多功能性的例子都包含以上两点，酶的复杂结构和进化过程中的不完美控制都可能赋予酶的新催化功能。2.1.1 脂肪酶的催化多功能性脂肪酶是一类来源比较广泛，商业上易得的生物催化剂，目前有些脂肪酶催化的有机反应已经成功应用于工业化的生产中。因此，对于脂肪酶的研究也备受关注3a-c，从而脂肪酶催化多功能性也不断被报道出来。首次报道了酶促C-C键Michael加成反应的是Berglund4课题组。他们将CAL B上105位的丝氨酸突变成丙氨酸，从而实现了CAL B快速催化1,3-二羰基化合物与, -不饱和羰基化合物的Michael加成反应（如图2-1）。由于突变增强

41、了组氨酸夺取质子的能力，从而很大程度上提高CAL B催化Michael加成反应的效率，所以该反应可以在10分钟完成。图2-1 CAL-B突变酶催化的1,3-二羰基化合物与,-不饱和羰基化合物的Michael加成反应我们课题组研究发现CAL-B也可以催化C-S键的生成的新功能5。CAL-B能够催化乙烯酯与硫醇的加成反应来合成硫醚类的化合物。非常有趣的是硫醇的加成位置可以通过反应的溶剂来调控（如图2-2）。在异丙醚中，该反应可以得到马氏（Markovnikov）加成产物。然而当该反应在DMF中进行时，CAL-B可以催化二者发生反马氏（anti-Markovnikov）加成反应。图2-2 脂肪酶催化

42、硫醇与乙烯酯的反应Berglund课题组还CAL B进行深入的研究，他们提出了, -不饱和羰基化合物与硫醇Michael加成反应的中间体6（图2-3）。中间体为：氧穴可以结合底物中的羰基，组氨酸与天冬氨酸协同夺取质子。通过化学计算表明丝氨酸会与组氨酸形成氢键，因而丝氨酸的存在会降低组氨酸与天冬氨酸协同夺取质子的能力。根据这一理论，他们采取突变的方法来提高酶的催化效率。他们将催化中心的丝氨酸突变成丙氨酸，实验结果显示突变酶催化活性提高了60多倍。图2-3 甲基硫醇与丙烯醛的Michael 加成反应中计算的模型。Gotor课题组在对水解酶研究中，发现水解酶Chirazyme L-27可以催化二级胺

43、与丙烯腈的Michael加成反应（图2-4）。更有趣的是他们在研究中发现环戊胺的活性要大于环己胺，而环己胺的活性要大于二乙胺的活性。图2-4 水解酶催化二级胺与丙烯腈的Michael加成反应。Berglund课题组还发现正己醛的羟醛缩合8反应可以由CALB催化发生（图2-5）。虽然这个反应没有立体选择性，但它的非对映体选择性与自发的反应有很大的区别。实验事实证明，用丙氨酸代替丝氨酸后羟醛缩合反应活性大约增加了2倍。这个反应的机理与Michael加成类似，都是通过形成烯醇式中间体进行的。图2-5 水解酶催化正己醛的aldol反应。Berglund和Brinck都报道了己醛或丙醛的aldol反应可

44、以用CALB在环己烷中催化进行 9a-b。将酶中丙氨酸突变为丝氨酸后，反应的活性提高了4倍，但是这个反应并没有立体选择性。针对脂肪酶催化aldol反应立体选择性的问题，余孝其课题组10在水相中研究了7 种脂肪酶催化含芳香醛与丙酮反应。结果发现在猪胰脂肪酶PPL的催化下，该反应可以得到一定手性的产物，其ee值为43%（图2-6）。图 2-6 水相中脂肪酶催化的羟醛缩合反应我们课题组报道了在DMSO溶剂中，嘧啶类化合物与丙烯酰氧基丙酸乙烯酯的碳氮键Michael加成反应可以利用Amano Lipase M11来催化，合成了一系列的含有嘧啶乙烯酯衍生物（图2-7）。Gotor12a-b课题组发现仲胺

45、与丙烯腈反应可以用CALB在甲苯中催化进行，结果显示CALB具有很好的Michael加成活性。根据催化三联体理论，他们提出了催化机理。酶中的组氨酸残基和天冬氨酸残基协同负责质子的转移，催化中心的阴离子穴可以结合腈基用于稳定过渡态。图 2-7脂肪酶催化嘧啶与丙烯酰氧基丙酸乙烯酯的Michael加成反应 2.1.2 蛋白酶的催化多功能性Lee13报道了在水相中糜蛋白酶可以先催化三甲氧基硅烷的水解，然后催化产物的缩合得到硅醚（图 2-8）。图 2-8 青霉素G 酰化酶催化的别嘌醇与乙烯酯的Markovnikov 加成反应我们课题组14a-c研究非水介质酶促反应时，发现在有机溶剂中，咪唑与丙烯酸甲酯的

46、Michael加成反应可以用枯草杆菌蛋白酶进行催化（图 2-9）。研究表明，该蛋白酶具有广泛的底物适应性和结构复杂性，如嘧啶类和嘌呤类，都能做为加成反应的供体。在疏水性溶剂中，底物可以完全转化为产物。图 2-9蛋白酶催化咪唑、嘧啶、嘌呤的 Michael加成反应 2.1.3 酰化酶催化加成反应我们课题组15在研究中发现别嘌醇与羧酸乙烯酯的反应可以用青霉素 G 酰化酶来催化，得到Markovnikov加成产物（图 2-10），利用该酶能够高效地催化别嘌醇和一系列不同结构的乙烯酯发生Markovnikov加成反应，我们还研究了乙烯酯结构对酶促Markovnikov加成反应的影响。接着通过考察空白、

47、失活酶、牛血清蛋白等催化对照实验来验证青霉素 G 酰化酶的活性中心起到催化作用。但是令人感到意外的是，酶催化反应并没有立体选择性。图 2-10 青霉素 G酰化酶催化的别嘌醇与乙烯酯的 Markovnikov 加成反应我们还针对其他的酰化酶展开了研究，发现了碳-氮键的Markovnikov加成反应可以用活性中心含有两种锌离子的D-氨基酰化酶催化进行16a-b。嘧啶类、唑类、嘌呤类等氮杂环化合物都可以做该反应底物，潜在生物活性的氮杂环衍生物可以利用D-氨基酰化酶催化合成得到。我们同样通过无酶、失活酶、牛血清蛋白催化与活性位点抑制的对照实验证明了Markovnikov加成是酶催化过程。根据实验结果，

48、我们提出了酰化酶催化Markovnikov加成反应可能的催化机理（图 2-11）。首先，酶活性中心的一个锌离子起到氧阴离子穴的作用，与乙烯酯中的羰基进行配位，从而影响乙烯酯的碳碳双键的电荷分布，进而使得与氧相连的碳带部分正电荷，羰基就被活化了，而这种正电荷更易于被亲核进攻；其次，酶催化中心的天冬氨酸残基夺取氮原子上的质子，形成亲核试剂，再加成到乙烯酯的-碳上。这个机理中-碳上的负电荷被活性中心的锌离子稳定，天冬氨酸又作为质子传递媒介完成反应。图 2-11D-氨基酰化酶催化的 Markovnikov 加成反应的推测机理 我们还针对D-氨基酰化酶展开了进一步的研究，发现了D-氨基酰化酶也能催化碳-

49、碳键的Henry反应17。一系列的硝基烷烃和醛可以做为该反应底物，利用D-氨基酰化酶催化合成一系列具有潜在生物活性的硝基化合物。我们同样通过无酶、失活酶和牛血清蛋白催化的对照实验证明了Henry反应是酶催化过程（图 2-12）。图 2-12 D-氨基酰化酶催化4-硝基苯甲醛与硝基乙烷的 Henry反应依据D-氨基酰化酶催化Markovnikov加成反应的机理，我们课题组推测锌离子依赖型的酰化酶还应该具有催化Michael加成的功能。我们进而设计了一些试验来验证，实验结果正与我们的推测一致，氮杂环化合物与丙烯酸酯的碳-氮键的Michael加成反应18可以利用D-氨基酸酰化酶做催化剂来实现，以与1

50、,3-二羰基化合物与共轭稀醛或稀酮的碳-碳键的Michael加成（图 2-13）。图 2-13 D-氨基酸酰化酶催化 1,3-二羰基化合物与 ,-不饱和化合物的 Michael 加成 2.1.4 酯酶催化氧化反应Altenbuchner19和Shimizu20两个课题组发现，当反应体系中含有过氧化氢或过氧酸时，一些酯酶可以显示出氧化酶的活性，即催化过氧化反应。研究表明，由于酰化反应与过氧化反应具有一样过渡态和酶-酰基复合物中间体，从而导致了酯酶的催化多功能性（图 2-14）。图 2-14 非血红素过氧化酶催化的酯水解反应和过氧化反应机理。2.1.5 转氨酶的催化多功能性西南大学的He课题组针对

51、转氨酶进行了系统的研究，发现谷氨酰胺转氨酶可以催化硝基烷烃与醛的Henry反应21，得到了Henry反应产物（图 2-15），利用该酶能够高效地催化硝基烷烃和一系列不同结构的芳香醛发生Henry反应， 且研究了醛的结构对酶促Henry反应的影响。接着通过考察空白、失活酶、牛血清蛋白等催化对照实验来验证了谷氨酰胺转氨酶的活性中心起到催化作用。图 2-15 酶催化4-硝基苯甲醛与硝基甲烷的Henry 反应2.1.6 其他酶的催化多功能性早在1921 年Neuberg和Hirsch22a-c这两位科学家就发现酵母全细胞能够催化额外的反应（图2-16）。接着Ohta课题组23报道了芳基丙二酸酯脱羧酶可

52、以催化aldol反应，他们在试验中发现酶的催化新功能与天然活性都经历一个烯醇负离子的中间体。而酵母丙酮酸酯脱羧酶能够催化乙醛和苯甲醛的aldol反应，生成(R)-苯基乙酰基甲醇。Gerlt研究组24a-b发现N-酰基氨基酸消旋酶具有催化脱水反应的功能（图 2-17）。图2-16丙酮酸脱羧酶催化乙醛和苯甲醛的立体选择性缩和反应。 图2-17 N-酰基氨基酸消旋酶催化脱水反应 Janssen课题组25报道了负离子亲核试剂与环氧化合物的立体选择性开环反应可以由卤代醇脱卤酶（Agrobacterium radiobacter AD1）催化发生，产物 ee 值围在90%99%。研究发现 Br-, Cl-

53、, I-, CN-, NO2-, N3-, OCN-, SCN-和 HCOO-等9个负离子都可以作为亲核试剂，而含硫化合物、二价的负离子和非离子的伯醇和氨类则不能反应，这表明酶只能接受线型的一价负离子作为底物（图 2-18）图 2-18卤代醇脱卤酶催化的环氧开环反应 Griengl 课题组报道了第一个生物催化的不对称Henry反应26，他们发现硝基甲烷和苯甲醛的不对称Henry反应可以被醇腈裂合酶(来源于 Hevea brasiliensis)催化，在室温条件下与PBS 缓冲液和TBME 混合溶液中反应 48 小时，产率可以达到 63%，ee值为 92%（图 2-19）图2-19 HbHNL催

54、化硝基甲烷与醛的加成反应许多课题组在研究中发现9-硫代和10-硫代硬脂酸酯类化合物的磺化氧化反应 27和9-氟代硬脂酸酯类化合物的羟基化反应28可以通过去饱和酶催化得到。而来自于两种细菌的异构酶在pH=6.8的磷酸缓冲溶液中可以催化水和3E-卤代丙烯酸酯的 Michael加成反应29等，酶的催化多功能性不但拓宽了生物催化剂在有机合成中的应用，丰富了有机合成方法学，而且为生命体系中复杂分子的合成提供了一种高效、绿色的途径。对现有酶活性位点进行一定程度的人工修饰，能够得到新的多功能性酶或者创造出以多功能性为主要活性的酶。随着蛋白质工程和酶促多功能性研究的不断深化，酶在不对称合成与生命体系中必定会取

55、得更大突破。2.2 酶促串联反应串联反应因其高效、多样的合成优势备受化学家青睐。而酶具有催化多种反应的功能，所以将酶催化的多种反应的功能加以组合，并以多步串联和一锅转化的方式来实现多种生物活性化合物合成，这对有机合成方法学具有重要的意义。2.2.1单酶催化串联反应在研究中发现丝氨酸羟甲基转移酶30能够催化三种非天然的反应， 包括氨基丙二酸酯的脱羧反应、氨酸的逆羟醛缩合反应以与丙氨酸的消旋化反应。头孢菌素 C 合成酶31能催化五元环到六元环的扩环反应和甲基上的羟基化反应（图 2-20）图2-20 eukaryotes中一种头孢菌素C合成酶催化两种不同的反应 双环2，2，2辛烯二酮是非常重要的有机

56、合成中间体，Muller等人32发现了在氯仿中，固定化酪氨酸酶可以利用“一锅法”催化苯酚串联羟基化-氧化-Diels-Alder反应生成双环2，2，2辛烯二酮（图 2-21）。首先，是由酪氨酸酶催化苯酚羟基化生成邻苯二酚。其次，邻苯二酚在酪氨酸酶的作用下进一步被氧化成邻位苯醌。最后，苯醌与烯烃化合物发生Diels-Alder反应得到最终产物。图 2-21 单酶催化羟基化-氧化-Diels-Alder的串联反应 Beifuss课题组33在研究漆酶时发现：漆酶可以催化串联的氧化-Michael加成-氧化-Michael加成反应生成一系列苯并呋喃类衍生物（图 2-22）。首先，漆酶催化氧化苯酚生成邻二苯醌。其次，漆酶催化1，3-二羰基化合物对邻二苯醌发生一个Michael加成反应。再者，漆酶又催化氧化苯酚生成邻二苯醌。最后在漆酶的作用下，1，3-二羰基化合物上的羰基氧对邻二苯醌又发生一个Michael加成反应生成最终的苯并呋喃类衍生物。机理如下：图 2-22 漆酶催化串联反应